Анализ гена человека, кодирующего возможный раковый антиген mo-tes-391



Скачать 302,64 Kb.
страница1/2
Дата02.06.2018
Размер302,64 Kb.
  1   2

Анализ гена человека, кодирующего возможный раковый антиген MO-TES-391




Адьянова Занда.

Тьютор: Купраш Дмитрий Владимирович


МГУ им. Ломоносова факультет биоинженерии и биоинформатики 1 курс




ВВЕДЕНИЕ.
Ранняя диагностика онкологических заболеваний неинвазивными методами остается острейшей проблемой медицины. Известно, что при злокачественной трансформации клетки возможна ре-экспрессия генов и их продуктов, «запрещенных» в норме для данного вида клетки и ткани. Классическими примерами является альфа-протеин при гепатомах, и целое семейство MAGE-антигенов, которые в норме экспрессируются только в клетках репродуктивной системы, таких как семенники и плацента. В некоторых случаях в раковых клетках происходит оверэкспрессия обычных «разрешенных» генов и антигенов. Для некоторых видов рака, таких как рак простаты, выявлены и успешно используются маркеры, которые определяются иммунологическими методами в сыворотке крови пациентов, и поэтому легко совмещаются с обычным анализом крови. Попытки выявить «универсальные» раковые антигены, определяемые серологически или иммунологически, пока успехом не увенчались.
Один из современных экспериментальных подходов к этой проблеме – метод серологического скрининга, который позволяет получить последовательности мРНК, предположительно кодирующих раковые антигены.
Метод поиска раковых антигенов, не требующий предварительного культивирования цитотоксических Т-лимфоцитов пациента, был предложен в 1995 году Сахином (Sahin) и коллегами. Этот метод, названный SEREX (серологический анализ экспрессионных клонотек), базируется на изучении B-клеточного репертуара пациента с целью поиска иммуногенных для него антигенов.
С помощью метода SEREX уже было идентифицировано несколько новых раковых антигенов, дальнейшее изучение которых представляет значительный интерес, в частности был идентифицирован потенциальный раковый антиген MO-TES-391. Гуморальный ответ на продукт MO-TES-391 обнаруживается более чем у 10% больных раком кишечника, что является очень хорошим показателем для этого типа рака, для которого пока не обнаружено хороших серологических маркеров ранней диагностики. Ген, кодирующий MO-TES-391, был ранее описан как длинная мРНК KIAA1864 с неизвестной функцией. Только что появилось сообщение о клонировании мышиного ортолога этого гена, гидрина (hydrocephalus-inducing protein). Оказалось, что мутация в гене гидрина приводит к развитию гидроцефалии у мышей. Кроме того, оказалось, что в N-концевой части мышиного белка имеется так называемый "Major sperm protein domain", что указывает на возможное наличие у этого белка физиологической функции в печени. Пока неясно, существует ли какая-либо связь между экспрессией гидрина в мозгу и в семенниках и иммунным ответом на этот белок у больных раком кишечника.
Сплайсинг - это преобразование первичного транскрипта – пре-мРНК, получаемого в процессе транскрипции гена (молекулы ДНК), когда из молекулы пре-мРНК удаляются участки, соответствующие некодирующим нуклеотным последовательностям исходного гена – интронам, а оставшиеся участки – экзоны соединяются в одну цепь. Сплайсинг осуществляется сплайсосомой – белковым комплексом, включающим ядерные и цитоплазматические РНП. Об альтернативном сплайсинге говорят тогда, когда сплайсинг одной и той же пре-мРНК проходит по-разному и дает разные формы мРНК, называемые изоформами.

Во время написания работы в журнале Human Molecular Genetics, Vol. 12, №10 была опубликована первая статья, посвященная исследуемой теме, «Congenital hydrocephalus in hy3 mice is caused by a frameshift mutation in Hydin, a large novel gene» (Brian E. Davy and Michael L. Robinson). В ней длинный транскрипт KIAA1864 получил название Hydin.


Hydin и еще один неисследованный ранее ген Vac14 были идентифицированы на 8-ой хромосоме трансгенетической вставочной мутации OVE459, побуждающей гидроцефалию у гидроцефалус3 (hy3) линии мышей. Hydin, длиной 340 кб, состоит из 86 экзонов. И полная длина его транскрипта, кодирующего белок из 5099 аминокислот, составляет 16 кб.


План работы.
Поиск возможных мутаций и сплайс-вариантов транскриптов гена MO-TES 391 проводился при помощи анализа доступных баз данных EST. Данные, полученные при компьютерном анализе, будут проверяться в лаборатории при помощи PCR с экзон-специфическими праймерами на первой цепи кДНК, полученной обратной транскрипцией, в качестве матрицы (RT-PCR). В качестве материала для обратной транскрипции будет использована РНК из нормальных и опухолевых тканей.
EST – это маленькие «кусочки» последовательности ДНК (обычно от 200 до 500 нуклеотидов в длину), полученные путем соединения одного или двух концов определенного гена. Идея состоит в том, чтобы сиквенсировать кусочки ДНК, которые представляют гены, экспрессированные в некоторых клетках, тканях или органах различных организмов. Эти кусочки используют для вычленения гена из части хромосомной ДНК по соответствию пар. Но при выделении генов из геномных последовательностей различных организмов возникают сложности, связанные с размером генома и зависящие от отсутствия или присутствия интронов, прерывающих последовательность гена, кодирующую белок.

Материалы и методы.
По транскрипту, полученному в Лаборатории молекулярной иммунологии была найдена гипотетическая аминокислотная последовательность белка (т.к. эволюционные и сплайсинговые изменения нуклеотидной последовательности менее отражается на белковых структурах). Проведя анализ этой аминокислотной последовательности с помощью программы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), получили список родственных белков, из них был выбран наиболее близкий человеческий белок (similar to hypothetical protein DKFZp434D0513.1). В базе данных на сайте NCBI нашли его нуклеотидную последовательность (XM_030075.5), и уже непосредственно с ней проводилась дальнейшая работа.
Сначала искали ее возможные вариации при помощи программе BLAST в базе данных EST_human. И полученные данные занесли в электронную таблицу при помощи программы Excel (blast.xls). Затем для сравнения провели поиск по этой же последовательности (XM_030075.5) в базе данных UniGene и так же построили таблицу (unigene.xls).
После по полученным таблицам в программе Excel фильтром была произведена сортировка полученных данных по типу тканей (нормальная, ткань раковой опухоли, либо ткань, пораженная склерозом), из которых были получены экспрессии.
Далее для исследования соответсвия полученой в лаборатории нуклеотидной последовательности MO-TES-391 предсказанной экзон-интронной структуре гена использовался BLAST поиск по последовательности генома человека ("genome-BLAST"), с просмотром результатов поиска одновременно с картой предсказанных экзонов в системе NCBI Genome Viewer. Обнаруженные несоответствия исследовали с помощью программы ORF Finder на предмет возможности кодирования ими иммуногенных ("новых" с точки зрения иммунной системы) эпитопов.
Результаты.
В результате анализа нуклеотидной последовательности XM_030075.5 с помощью программы BLAST были найдены 47 сходных исследуемой последовательностей. Сортирование по типу тканей, из которых были получены экспрессии показало, что 13 получены из раковых клеток, 32 – из нормальных и 2 – из клеток, пораженных склерозом. Информация о тканевой принадлежности транскриптов была получена из описания последовательностей. Таблицу с рассортированными данными, полученными в результате поиска можно посмотреть в прикрепленном файле Book.xls (лист1). Графически результат поиска выглядит следующим образом (рис.1)





Поделитесь с Вашими друзьями:
  1   2


База данных защищена авторским правом ©grazit.ru 2017
обратиться к администрации

    Главная страница