Провоспалительные цитокины в регуляции процессов воспаления и репарации 03. 03. 03 иммунология



страница1/7
Дата15.07.2017
Размер1,14 Mb.
  1   2   3   4   5   6   7




На правах рукописи

ВАРЮШИНА

Елена Анатольевна


ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЦИТОКИНЫ В РЕГУЛЯЦИИ ПРОЦЕССОВ ВОСПАЛЕНИЯ И РЕПАРАЦИИ

03.03.03 – иммунология


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Санкт-Петербург

2012

Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства, г. Санкт-Петербург


Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Симбирцев Андрей Семенович

доктор биологических наук Гудима Георгий Олегович
Официальные оппоненты: Ярилин Александр Александрович,

доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом клеточной иммунологии «ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России;


Сапожников Александр Михайлович,

доктор биологических наук, профессор,

рук. лаборатории клеточных взаимодействий

Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН;


Полевщиков Александр Витальевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой фундаментальной медицины Дальневосточного Федерального университета.
Ведущая организация: НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова РАМН.

Защита диссертации состоится 27 марта 2013 г. в 14-00 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.017.01 в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24, корп. 2.



С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России.

Автореферат разослан «_____» ______________ 2013 года.




Ученый секретарь

Совета по защите докторских и

кандидатских диссертаций

доктор медицинских наук Сеславина Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы

Изучение роли провоспалительных цитокинов в иммунном и воспалительном ответе представляет собой важное направление современной иммунологии. Взаимодействия между различными типами клеток обеспечивают стабильность тканей организма в норме и определяют исход патологических процессов. Важную роль в поддержании нормального тканевого гомеостаза и при воспалении играют цитокины. Провоспалительные цитокины, такие как IL-1, IL-6 и TNF-α, продуцируются в ответ на внедрение патогенов и повреждение тканей, и стимулируют развитие местной воспалительной реакции, которая направлена на элиминацию патогена и заживление тканей (Dinarello C.A., 2000; Werner S., Grose R., 2003). IL-8 (СХС-хемокин) является основным хемоаттрактантом для нейтрофилов, которые первыми появляются в очаге воспаления и отвечают за элиминацию микроорганизмов. В случае, когда местное воспаление неэффективно, эти медиаторы продуцируются в тканях в больших количествах, появляются в циркуляции и активируют острофазовый ответ или воспалительную реакцию. Именно поэтому пристальное внимание исследователей привлекает изучение роли провоспалительных цитокинов, прежде всего в регуляции развития местного воспалительного процесса, а затем и регенерации тканей.

Среди провоспалительных цитокинов важнейшим медиатором развития воспаления считается IL-1. Он обладает широким спектром биологической активности и стимулирует функции практически всех клеток, участвующих к защитных реакциях, включая клетки центральной нервной, эндокринной и гематопоэтической систем. Действие IL-1 может реализовываться как на системном, так и на местном уровне. Важная роль IL-1 в фазе воспаления подтверждается тем, что экспрессия мРНК и уровни продукции белков IL-1 и IL-1 повышаются на ранних стадиях заживления ран (Grellner W., 2002; Sato Y., Ohshima T., 2000). В связи с этим и первые проявления биологического действия IL-1 сводятся к активации местных защитных реакций. Экспериментальное введение IL-1 в кожу вызывает покраснение, отек и инфильтрацию тканей лейкоцитами. Поскольку практически все клетки организма имеют рецепторы к IL-1, этот цитокин очень быстро активирует практически все типы клеток, участвующих в формировании локальной воспалительной реакции.

Важные биологические функции IL-1 явились предпосылкой для его использования в качестве лекарственного препарата. Было предпринято несколько попыток использования IL-1 и IL-1 для восстановления костномозгового кроветворения у раковых больных после высоких доз химиотерапии (Гершанович М.А. с соавт., 2000). Системное применение IL-1 в этих исследованиях имело положительное клиническое действие, но было ограниченным из-за побочных эффектов введения IL-1 у человека, поскольку терапевтическая доза и токсическая были близкими. Кроме того, IL-1 может быть введен местно, непосредственно в воспалительный очаг, чтобы активировать местные защитные механизмы и избежать нежелательных проявлений острофазового ответа. Представляет большой интерес раскрытие возможных механизмов локального действия IL-1. В связи с этим, данная работа является актуальной и имеет не только теоретическое, но и практическое значение.


Цель работы:

Исследование механизмов регуляции цитокинами местных воспалительных процессов и заживления ран в экспериментальных моделях на животных и у человека.


Задачи работы:

1. Исследовать особенности продукции провоспалительных цитокинов при ряде гнойно-воспалительных процессов и их связь с функциональной активностью нейтрофилов и особенностями субпопуляционного состава лимфоцитов в периферической крови.

2. Методами иммуногистохимии исследовать продукцию провоспалительных цитокинов в слизистой оболочке желудка у детей с хроническими гастродуоденальными заболеваниями при инфекции H.pylori.

3. Исследовать ранозаживляющее действие мазевой формы рекомбинантного IL-1 человека на модели осложненных ран у мышей. Оценить параметры иммунитета животных при локальном применении мазевой формы IL-1. Провести ультраструктурный анализ формирования эпителия, оценить экспрессию белков плотных контактов окклюдина, ZO-1 и клаудина-1 иммуногистохимическими методами.

4. Изучить ранозаживляющее действие мазевой формы рекомбинантного IL-1 человека у пациентов с длительно незаживающими ранами и трофическими язвами. Исследовать изменения цитологической картины и функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов в раневом очаге под действием IL-1.

5. Исследовать механизмы лечебного действия рекомбинантного IL-1 человека при местном применении у больных с гнойно-воспалительными процессами, оценить его влияние на содержание цитокинов в очаге воспаления, на цитологическую картину и на сравнительную динамику показателей иммунитета в очаге воспаления и в периферической крови.


Научная новизна работы

В исследовании показано наличие взаимосвязей локальной продукции цитокинов IL-1α, IL-1, IL-8 и TNF- с активностью воспаления, а также тяжестью заболевания у пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями (абсцессами легких, эмпиемой плевры, флегмонами ЧЛЛ). Впервые установлено, что у детей с лимфопролиферативным синдромом локальная продукция IL-1α, IL-1, IL-6 и IL-8 в ткани глоточной миндалины существенно различается при вирусных и бактериальных инфекциях.

В работе впервые проведена комплексная оценка иммунного статуса у лиц с ХГРС и установлено наличие изменений, выражающихся в увеличении количества HLAII+, CD16+ и CD19+ лимфоцитов, повышении спонтанной продукции IL-8 и снижении индуцированной продукции IL-1 и IL-2 в крови, появлении высоких уровней IL-1, IL-6 и IL-8 в содержимом верхнечелюстных пазух.

Установлена взаимосвязь между повышением продукции IL-1β и IL-8 в слизистой оболочке желудка и наличием инфекции H.pylori у детей с хроническими гастродуоденальными заболеваниями.

Впервые показано, что мазевая лекарственная форма для местного применения, содержащая рекомбинантный IL-1 человека, усиливает заживление ран в экспериментах на мышах, что проявляется в уменьшении размеров раны и осуществляется за счет повышения количества клеток в грануляционной ткани, усиления эпителизации, которое обусловлено, в том числе, ускорением процессов дифференцировки клеток в эпидермисе, а также образования эпидермального барьера.

В работе впервые изучены механизмы иммуностимулирующего действия рекомбинантного IL-1β человека при местном применении для терапии гнойно-воспалительных заболеваний (абсцесс легкого, хронический гнойный риносинусит, флегмоны челюстно-лицевой области), а также исследовано влияние мазевой формы IL-1β на репарацию длительно незаживающих ран и трофических язв нижних конечностей у человека.


Теоретическая и практическая значимость

Теоретическая значимость обусловлена тем, что в работе расширены представления об участии провоспалительных цитокинов в процессах местного воспаления и репарации. Описаны особенности иммунного статуса, в том числе продукции цитокинов, а также состояния фагоцитарной системы, приводящие к нарушениям в протекании воспалительного процесса и заживления ран. Предложено использовать экзогенный рекомбинантный IL-1 человека, который вносится непосредственно в очаг поражения. Выявлено, что IL-1 играет ключевую роль в процессах локального воспаления и заживления ран в экспериментах на животных и у человека.

Значение полученных результатов исследования для практики подтверждается тем, что разработаны и внедрены: способ лечения повреждений слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта (Патент на изобретение № 2355415 от 10.01.2009), композиция для лечения повреждений слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта (Патент на изобретение № 2361606 от 10.01.2009), интерлейкинсодержащая композиция (Патент на изобретение № 2432170 от 10.10.2010).

На основании полученных результатов выявлена значимость определения локальной продукции цитокинов в очаге воспаления для оценки особенностей протекания воспалительного процесса. Показана информативность метода иммуногистохимии для изучения продукции цитокинов при воспалительных процессах в ЖКТ и респираторном тракте.

В работе показано, что IL-1 обладает ранозаживляющей и местной иммуностимулирующей активностью, раскрыты возможные механизмы действия цитокина.
Внедрение результатов работы в практику

Результаты внедрены в практическое здравоохранение в ФГБУ "СПб НИИ ЛОР" МЗ России, г. Санкт-Петербург, в клинике торакальной хирургии Военно-Медицинской Академии им. С.М. Кирова, г. Санкт-Петербург; в Центре лечения хирургических инфекций, г. Санкт-Петербург, Балтийской клинической центральной бассейновой больнице им. Чудновского, г. Санкт-Петербург, в клинике челюстно-лицевой и пластической хирургии СПбГМУ им. Павлова, г. Санкт-Петербург.

Результаты диссертационной работы могут быть использованы в научно-исследовательских институтах, занимающихся изучением цитокинов: ФГБУ «ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, г. Москва, Военно-Медицинской Академии им. С.М. Кирова, г. Санкт-Петербург, ФГБУ «НИИ экспериментальной медицины» СЗО РАМН, г. Санкт-Петербург и других.
Основные положения, выносимые на защиту


  1. Уровни провоспалительных цитокинов в очаге воспаления отражают особенности протекания воспалительных процессов (активность, распространенность процесса, наличие инфекции) у человека.

  2. При гнойно-воспалительных заболеваниях у человека выявляется снижение функций нейтрофилов в очаге воспаления, эти нарушения затрудняют разрешение воспаления.

  3. Применение мазевой формы, содержащей рекомбинантный IL-1β человека, усиливает заживление ран в экспериментальной модели у мышей. Под действием IL-1β происходит уменьшение размеров ран, увеличивается количество клеток в грануляционной ткани и усиливается эпителизация.

  4. Местная терапия с применением мазевой формы, содержащей рекомбинантный IL-1β человека, не оказывает действия на такие параметры как лейкоцитарный состав периферической крови, размер селезенок и количество спленоцитов в экспериментах на мышах.

  5. Применение мазевой формы, содержащей рекомбинантный IL-1β человека, у пациентов с длительно незаживающими ранами и трофическими язвами нижних конечностей активирует нейтрофильные гранулоциты, а также вызывает увеличение относительного количества макрофагов и клеток соединительной ткани в раневом очаге.

  6. Местное применение рекомбинантного IL-1β человека приводит к усилению местных факторов защиты в очаге воспаления у пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями. Механизмы действия IL-1β связаны с увеличением продукции провоспалительных цитокинов и стимуляцией за их счет функций нейтрофилов. Действие IL-1β при местном применении у человека ограничивается воспалительным очагом.


Личный вклад соискателя состоит в участии во всех этапах выполнения диссертационного исследования; проведении анализа состояния вопроса по данным современной литературы; статистической обработки данных; интерпретации полученных результатов; подготовке основных публикаций по выполненной работе. Цитологические исследования, оценка бактерицидной, фагоцитарной функций нейтрофилов, иммуногистохимическое исследование продукции цитокинов, гистохимические исследования, оценка субпопуляций лимфоцитов методом проточной цитометрии при ХГРС выполнены автором. Экспериментальные исследования на животных выполнялись автором вместе с соавторами работ.
Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы доложены на российских и международных конференциях: Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (6-ом, г. Новосибирск, 1996 г., 13-ом, г. Санкт-Петербург, 2003 г., 16-ом, г. Санкт-Петербург, 2006 г.), 2nd Joint Meeting of the ICS and ISICR (Иерусалим, 1998 г.), Научной конференции с международным участием им. акад. В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», (г. Санкт-Петербург, 2-ой, 1998г; 3-ей, 1999 г; 5-ой, 2001 г; 6-ой, 2002; 7-ой, 2003г; 11-ой, 2007 г,), 4th World Congress on Inflammation (Рaris, France, 1999 г.), 2-ом Съезде иммунологов России (Сочи, 1999 г.), 5th World Congress on Trauma, Shock, Inflammation and Sepsis – Pathophysiology, Immune Consequences and Therapy (Munich, 2000), Euroconference on molecular aspects of the initiation and regulation of immune response “Communication within the immune system” (San Feliu de Guixoils, 2001), European Respiratory Society Annual Congress (12th, Stockholm, 2002; 17th, Stockholm, 2007; 19th,, Vienna, 2009; 21st, Amsterdam, 2011), 10-ом Всероссийском научном форуме «Санкт-Петербург – Гастро» (г. Санкт-Петербург, 2008 г), 8-ом Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (г. Москва, 2007 г), Объединенном иммунологическом форуме (г. Санкт-Петербург, 2008г.), 1-ом съезде российского общества хирургов-гастроэнтерологов «Актуальные вопросы хирургической гастроэнтерологии», (г. Геленджик, 2008), Межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии – междисциплинарные проблемы» (г. Санкт-Петербург, 2010 г.), Межрегиональном форуме «Клиническая иммунология и аллергология – междисциплинарные проблемы» (Казань, 2012).


Публикации

Основные результаты диссертации опубликовано в 71 печатной работе, из которых 21 статья в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций («European Cytokine Network», «Иммунология», «Вестник хирургии», «Российский иммунологический журнал» («Russian Journal of Immunology»), «Цитокины и воспаление», «Медицинская иммунология», «Грудная и сердечно-сосудистая хирургия», «Российская оториноларингология», «Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии»), 6 статей в научных журналах, 40 публикаций в материалах научных конгрессов и конференций, одна глава в книге, три патента.
Структура и объем диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, шести глав изложения результатов исследований, обсуждения результатов и списка литературы. Диссертация изложена на 296 страницах, включает в себя 20 таблиц и 30 рисунков. Список цитируемой литературы состоит из 368 источников, в том числе 62 отечественных и 306 иностранных.


СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Иммунологические исследования выполнены на базе лаборатории иммунофармакологии ФГУП Гос. НИИ ОЧБ ФМБА.



Выделение мононуклеаров и нейтрофилов из гепаринизированной венозной крови проводили, как описано у Boyum A., 1968, путем центрифугирования в градиенте плотности. Подсчет количества лейкоцитов и лейкоцитарной формулы крови, взятой с антикоагулянтом ЭДТА, проводили с помощью гематологического анализатора фирмы “Beckman Coulter”. Оценку субпопуляционного состава лимфоцитов крови проводили методом проточной цитометрии на проточном цитофлюориметре COULTER EPICS XL (“Beckman Coulter”, США) с использованием моноклональных антител к CD3, CD4, CD8, СD16, CD19, CD25 и HLA-DR (“Caltag”, США). Измерение концентраций цитокинов в сыворотке крови, супернатантах клеток и содержимом очагов воспаления проводилось методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием в качестве фермента пероксидазы хрена. Использовали тест-системы для определения IL-1α, IL-1β, IL-8, TNF-α (ООО «Цитокин», Россия) и IL-6 Quantikinine” (“R&D systems”, США) в соответствии с рекомендациями фирм-производителей, результаты считывали на спектрофотометре для планшетов (модель 3550 (Bio-Rad)). Индукцию продукции цитокинов проводили в цельной крови, в качестве индуктора использовали продигиозан. Содержание IL-2 в супернатантах клеток крови определяли с помощью IL-2-зависимой линии CTLL-2 в биологическом тесте (Gillis S. et al., 1978). Результаты учитывали на жидкостном сцинтилляционном счетчике (Rackbeta 1217, Wallac, Finland), Функции нейтрофилов. Направленную миграцию нейтрофилов под агарозой изучали по методу Nelson K.D, 1975. Уровень продукции активных форм кислорода нейтрофилами оценивали в НСТ-тесте в планшетах по методу Rook J.A.W. et al., 1985. Окислительный взрыв в фагоцитирующих клетках изучали методом люминол-зависимой хемилюминесценции в цельной крови на приборе Victor-2 (Финляндия). Адгезию нейтрофилов к пластику оценивали в тесте на планшетах. В тестах на планшетах результаты определяли на спектрофотометре для планшет модель 3550 (Bio-Rad). Фагоцитарную активность нейтрофилов оценивали с использованием опсонизированных дрожжей и подсчитывали результаты под микроскопом (Root R.K. et al., 1975). Уровень продукции активных форм кислорода нейтрофилами, полученными из очага воспаления, оценивали в НСТ-тесте на стеклах (Och H.D. et al., 1973). Подсчет цитологического состава на мазках крови и содержимого воспалительного очага, мазках-отпечатках из ран проводился под световым микроскопом после окрашивания по Романовскому-Гимзе. Для цитологического исследования с поверхности трофических язв и ран делали мазки-отпечатки по методу Покровской Т.М. (1942), клетки раневого очага получали по методу «поверхностной биопсии» по Камаеву М.Ф. (1970). При гнойно-воспалительных заболеваниях получали содержимое воспалительного очага аспирацией или делали смывы. Продукцию цитокинов в биоптатах и мазках клеток проводили методом непрямой иммуногистохимии с использованием моноклональных и поликлональных антител к IL-1α, IL-1β, IL-8, TNF-α (Гос. НИИ ОЧБ, Россия), IL-6 (R&D systems, Германия), вторых анти-мышиных или анти-кроличьих биотинилированных антител и конъюгата стрептавидин-щелочная фосфатаза («Sigma», США). Подсчитывали активность продукции цитокинов (среднее количество положительных клеток в поле зрения на срезе) при увеличении в 640 раз, в среднем на 3-х срезах с каждого биоптата. Оценивали частоту выявления продукции цитокинов (относительное количество пациентов в процентах, у которых определялась продукция цитокинов). Проводили гистохимические реакции на выявление миелопероксидазы (МПО) нейтрофилов с использованием диаминобензидина («Sigma», США) (Лойда и др., 1982), а также на выявление эндогенной перекиси водорода (Dannenberg A.M. et al., 1994).

В работе использовали рекомбинантный IL-1 человека (ФГУП Гос. НИИ ОЧБ ФМБА России) (в экспериментальных исследованиях) и созданный на его основе медицинский препарат «Беталейкин», разрешенный к клиническому применению (регистрационный номер 97/51/6) (в клинических исследованиях). Мазевая форма препарата представляла собой рекомбинантный IL-1 человека на ланолин-вазелиновой основе.

Получение биологического материала для исследований проводилось квалифицированными медицинскими работниками на базе клиник Санкт-Петербурга: ФГБУ «СПб НИИ ЛОР» МЗ России, клиники торакальной хирургии Военно-Медицинской Академии им. С.М. Кирова; на базах 1 и 4 хирургических отделений Центра по лечению хирургических инфекций (городская больница № 5 Санкт-Петербурга) и 1 и 2 хирургических отделений Балтийской клинической центральной бассейновой больницы Санкт-Петербурга; клинике челюстно-лицевой и пластической хирургии СПбГМУ им. Павлова, г. Санкт-Петербург; в консультативно-диагностическом центре для детей № 2 СПбГУЗ «Городская поликлиника № 23» и дневном гастроэнтерологическом стационаре детской поликлиники № 77 Приморского района г. Санкт-Петербурга.

Экспериментальные исследования выполнены во ФГУП Гос. НИИ ОЧБ ФМБА России. Использовали модель осложненного заживления полнокожной раны у мышей на фоне иммуносупрессии. Исследование влияния гидрокортизона (ГК) на параметры заживления ран у мышей выполнено на 211 белых беспородных мышах-самцах весом 22-25 г. (ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово» РАМН). Действие мазевой формы с содержанием IL-1 50 нг/мл изучено в опытах, в которых использовали 145 белых беспородных мышей-самцов весом 22-25 г. (ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово» РАМН) и 87 белых беспородных мышей-самцов SPF (specified pathogen free, не несущие специфицированную патогенную микрофлору) весом 30-45 г. (питомник Charles River, Венгрия). Мыши SPF содержались в стерильных условиях во время всего эксперимента. Мышам наносили раны скальпелем для кожных биопсий диаметром 4 мм (“Acupunch”, USA). Вводили ГК в/м 25 мг/кг («Гедеон Рихтер», Венгрия) один раз в день в течение всего опыта, первый раз – за один день до нанесения ран. Со следующего дня после нанесения ран наносили мазь с IL-1β (50 нг/мл) или плацебо (мазевую основу) ежедневно в течение опыта. Оценивали параметры заживления в динамике на 3, 5, 7, 9, 11, 13 сутки лечения.

Площади ран кожи у мышей определяли планиметрическим методом. Для этого раны фотографировали цифровой камерой, переносили на компьютер, площади ран измеряли с использованием компьютерной программы ImageJ 1,35r (NIH, США). Гистологические методы включали окраски по Масону и гематоксилином-эозином. Использовали систему визуализации изображений, состоящую из светового микроскопа DMLB, цифровой камеры DC 300 (Leica, Германия) и компьютера. Проводили электронно-микроскопическое исследование эпителия ран у мышей. Обработку ультратонких срезов проводили методом двойного контрастирования уранилацетатом и цитратом свинца, препараты просматривали в трансмиссионном электронном микроскопе JEM-100C (JEOL, Япония) (Миронов А.А. с соавт., 1994). Исследование экспрессии белков плотных контактов проводилось с помощью метода непрямой иммуногистохимии с использованием первых антител к окклюдину, клаудину-1 и ZO-1 (Zymed Laboratories, США), вторых антител, меченных FITC. Препараты изучали с использованием конфокального лазер­ного микроскопа Zeiss LSM510 (Carl Zeiss, Германия). Исследование экспрессии белков плотных контактов проведено сотрудниками Санкт-Петербургского Государственного университета.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерных программ SPSS 17,0 for Windows и «Excel». Подсчитывали среднее значение и ошибку среднего M ± m. Различия между группами оценивали с использованием Т-теста Стьюдента для независимых переменных, теста Вилкоксона-Манна-Уитни, ANOVA, сравнение парных показателей проводили с использованием парного Т-теста Стьюдента. Различия считались достоверными при вероятности 95% (р<0,05) или 99% (p<0,01).


РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение особенностей продукции провоспалительных цитокинов при гнойно-воспалительных заболеваниях у человека

Иммунологические исследования были проведены у пациентов с диагнозом «хронический гнойный риносинусит» (ХГРС) (71 человек), которые находились в стадии обострения заболевания. Для сравнительной оценки исследования проводили также у 49 условно здоровых доноров. Для исследований получали периферическую кровь, содержимое верхнечелюстных пазух носа у пациентов с ХГРС и кровь у доноров.

У пациентов с ХГРС общее количество лейкоцитов крови значительно не отличалось от показателей в группе доноров, находилось в пределах нормы, но при этом в формуле крови наблюдалось увеличение процента палочкоядерных и юных нейтрофилов. Оценка содержания субпопуляций лимфоцитов крови показала, что относительное и абсолютное количество лимфоцитов, количество CD3+, CD4+, CD8+, CD25+ лимфоцитов, а также соотношение CD4+/CD8+ не различалось между группами больных ХГРС и доноров (табл. 1). Относительное и абсолютное количество HLAII+ лимфоцитов было выше у больных ХГРС. Абсолютное число CD16+ клеток (NK клетки) было повышенным при ХГРС. Процент CD19+ (В клетки) у пациентов с ХГРС превышал показатели у доноров. Воспаление играет ключевую роль в патогенезе хронического риносинусита (Benninger M.S., et al., 2003; Hamilos D.L., 2000). Иммунологические показатели свидетельствуют о том, что больные ХГРС находились в стадии обострения хронического воспалительного процесса.

В группе пациентов с ХГРС наблюдалось снижение показателей индуцированной продукции IL-1 по сравнению с группой доноров (рис. 1А). Уровни спонтанной продукции IL-8 при ХРГС превышали таковые у группы доноров в среднем в шесть раз (рис. 1Б), при этом уровни индуцированной продукции IL-8 не различались между группами. У пациентов с ХГРС также выявляется дефицит продукции IL-1. Гиперпродукция IL-8 в периферической крови, по-видимому, отражает воспалительную реакцию, причиной которой является неэффективное местное воспаление.

Спонтанная продукция IL-2 не наблюдалась ни у больных, ни у доноров и была равна нулю. Показатели индуцированной продукции IL-2 были резко снижены у больных ХГРС по сравнению с донорами (рис. 2В). Низкие уровни продукции IL-2 свидетельствуют о снижении функциональной активности лимфоцитов у пациентов при ХГРС.

Поскольку к настоящему времени иммунный ответ в слизистой оболочке пазух носа при инфекциях остается недостаточно изученным, было проведено исследование продукции цитокинов, функций нейтрофилов и цитологической картины в содержимом верхнечелюстных пазух у больных ХГРС. В содержимом пазух были определены следующие цитокины: уровни IL-1 - 81,46 ± 29,44 пг/мл, выявлен в 56,7% случаев (n=64), IL-6 – 219,07 ± 25,29 пг/мл, определен в 64,5% случаев (n=62), IL-8 – 866,34 ± 181,09 пг/мл, обнаружен в 67,1% случаев (n=70). IL-1 не был выявлен ни у одного пациента. Проводили сравнение уровней цитокинов у одних и тех же пациентов в периферической крови и в очаге воспаления. Результаты показали, что в пазухах носа уровни IL-1 и IL-8 у пациентов с ХГРС превышают соответствующие показатели в сыворотке крови тех же пациентов, а также уровни цитокинов у доноров (табл. 2). Полученные данные согласуются с результатами Demoly P., et al., 1997, которые показали, что у пациентов с хроническим синуситом в лаважах из верхнечелюстных пазух содержатся значительные количества нейтрофилов, а уровни IL-8 повышены. При исследованиях было выявлено увеличение продукции IL-1β, IL-6 и IL-8, а также выраженная нейтрофильная инфильтрация в слизистой оболочке пазух носа у пациентов с острыми респираторными инфекциями (Bachert C., 1998).



Цитологическое исследование содержимого верхнечелюстных пазух проведено у 57 пациентов с ХГРС. Исследование показало, что преобладающим типом клеток в очаге воспаления являются нейтрофилы (83,89 ± 2,94%), в небольшом количестве наблюдаются макрофаги (1,51± 0,47%) и лимфоциты (5,15 ± 1,07%), а также эозинофилы (1,36 ± 0,33%). Эпителиальные клетки в препаратах присутствовали у 32 пациентов в количестве 9,00 ± 2,62% .
Таблица 1. Сравнительная оценка содержания субпопуляций лимфоцитов в периферической крови пациентов ХГРС и здоровых доноров


Груп-пы

Относительное количество клеток (%), M ± m

Лимфо-циты

CD3+

CD4+

CD8+

CD4+/

CD8+

CD25

HLA II

CD16

CD19

ХГРС

n=50

33,84 ± 1,28

62,03 ± 1,84

38,48 ± 1,50

24,09 ± 0,80

1,69 ± 0,09

2,56 ± 0,24

19,89 ± 1,73

14,87 ± 1,20

14,39 ± 1,54

Доноры n=45

35,27 ± 1,40

62,46 ± 2,11

40,02 ± 1,49

22,18 ± 1,03

1,99 ± 0,13

2,82 ± 0,31

12,20 ± 0,62

11,96 ± 0,94

9,27 ± 1,35

Р

>0,05

>0,05

>0,05

>0,05

>0,05

>0,05

0,0001

0,06

0,01


Груп-пы

Абсолютное количество клеток (млн/мл), M ± m

Лейко-циты

Лимфо-циты

CD3

CD4

CD8

CD25

HLA II

CD16

CD19

ХГРС

n=50

6,78 ± 0,32

2,21 ± 0,11

1,39 ± 0,09

0,86 ± 0,06

0,54 ± 0,03

0,06 ± 0,01

0,43 ± 0,04

0,32 ± 0,03

0,31 ± 0,03

Доноры n=45

5,95 ± 0,29

2,06 ± 0,13

1,32 ± 0,10

1,57 ± 0,52

1,25 ± 0,80

0,05 ± 0,01

0,25 ± 0,02

0,24 ± 0,02

0,26 ± 0,08

Р

>0,05

>0,05

>0,05

>0,05

>0,05

>0,05

0,004

0,03

>0,05

Таблица 2. Сравнение концентраций цитокинов в сыворотках крови



и в содержимом верхнечелюстных пазух носа у пациентов ХГРС

Цитокины

Концентрации (пкг/мл), M ± m

Сыворотка

крови, ХГРС

Содержимое пазух носа, ХГРС

Сыворотка

крови, норма

IL-1, n= 47


7,04 ± 1,54

81,46 ± 29,44 **

10,05 ± 2,01

IL-8, n=70

2,90 ± 1,65

866,34 ± 181,09***

7,83 ± 2,71

Примечание: концентрации цитокинов в содержимом пазух носа достоверно отличаются от сыворотки крови: ** - р < 0,01, *** p < 0,001. Парный Т-тест Стьюдента. Норма – условно здоровые доноры, n=42.


A

Б

В

Рисунок 1. Сравнительная оценка продукции IL-1 (А), IL-8 (Б) и индуцированной продукции IL-2 (В) клетками крови пациентов ХГРС (n=70) и условно здоровых доноров (n=48). Примечание: различия достоверны по сравнению с группой доноров, * p<0,05, ** p<0,01.



Поделитесь с Вашими друзьями:
  1   2   3   4   5   6   7


База данных защищена авторским правом ©grazit.ru 2017
обратиться к администрации

    Главная страница