Учебное пособие Якупов Т. Р. Молекулярная биотехнология Биоинженерия Казань 2016



страница3/7
Дата02.06.2018
Размер4,31 Mb.
1   2   3   4   5   6   7

3. Ферменты генной инженерии

В генетической инженерии используется большая группа ферментов. Успехи генетической инженерии стали возможны, прежде всего, благодаря изучению ферментов, позволяющих проводить химические операции с генетическим материалом. В генетической инженерии ферменты служат инструментами молекулярного манипулирования с генетическим материалом, где они выступают в роли "скальпеля", "ножниц" и "ниток для сшивания". Ферменты, применяемые при конструировании рекомбинантных ДНК, можно разделить на несколько групп:

- ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК (рестриктазы);

- ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы);

- ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);

- ферменты, позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК.

Рестриктазы

Рестриктазы – специфические эндонуклеазы, расщепляющие молекулу ДНК в строго определенных точках – сайтах рестрикции. Впервые были выделены из Е. coli в 1968 г.



Основной характеристикой рестриктаз является их субстратная специфичность. Сейчас известны следующие основные проявления специфичности этих ферментов: узнаваемая последовательность, место расщепления, зависимость действия рестриктаз от метилирования оснований в пределах узнаваемой последовательности.

Узнаваемая последовательность нуклеотидов в молекулярной биологии называется - сайт рестрикции и является наиболее важным параметром рестриктаз. Сайт рестрикции характеризуется последовательностью нуклеотидов, их числом, а также типом строения. Для большинства участков, узнаваемых рестриктазами, характерна вращательная симметрия второго порядка, т. е. они являются палиндромами. Несмотря на то, что  все рестриктазы узнают на ДНК строго определенные последовательности, различают 3 основных класса рестриктаз.

Рестриктазы 1-го класса осуществляют разрывы в произвольных точках молекулы ДНК, точнее на произвольном от сайтов рестрикции расстоянии.

Рестриктазы 3-го класса узнают и расщепляют ДНК на фиксированном от сайтов рестрикции расстоянии.

Рестриктазы 2-го класса расщепляют ДНК только внутри сайтов узнавания.

В молекулярной биотехнологии в целом, и в генной инженерии в частности, используются исключительно ферменты второго класса. В настоящее время выделено около 500 рестриктаз этого класса.

 Большинство рестриктаз класса 2 узнают последовательности, содержащие от 4 до 6 нуклеотидных пар, поэтому рестриктазы делят на мелко- и крупнощепящие. Мелкощепящие рестриктазы узнают тетрануклеотид и вносят в молекулы гораздо больше разрывов, чем крупнощепящие, узнающие последовательность из шести нуклеотидных пар. Это связано с тем, что вероятность встречаемости определенной последовательности из четырех нуклеотидов гораздо выше, чем последовательности из шести нуклеотидов. Если предположить, что участки узнавания рестриктаз распределены вдоль цепи ДНК случайно, то мишень для ферментов, узнающих последовательность (сайт) из четырех нуклеотидов, должна встречаться в среднем 1 раз через каждые 256 пар оснований, а для ферментов, узнающих шесть нуклеотидов, - через 4096 пар оснований.

В 1973 году Смит и Натанс предложили номенклатуру рестриктаз согласно которой:

1. Аббревиатура названия каждого фермента является производной от бинарного названия микроорганизма. К первой прописной букве названия рода добавляют две первые строчные буквы вида: Streptomyces albus - Sal, Escherichia coli – Eco.

2. В случае необходимости добавляют обозначение серотипа или штамма, например, Есо B.

3. Различные системы рестрикции - модификации, кодируемые одной бактериальной клеткой, обозначают римскими цифрами: Hind II, Hind I, Hind III (Haemophilus influenzae).

Рестриктазы по-разному расщепляют ДНК. Одни вносят разрывы по оси симметрии узнаваемой последовательности (Hpa I, Ssp I). Другие - со сдвигом, со  "ступенькой" (Pst I).

В первом случае образуются так называемые "тупые" концы, а во втором - "липкие", то есть фрагменты имеющие на своих концах однонитевые взаимно комплементарные участки. Такие фрагменты особенно удобны для создания рекомбинантных ДНК (рис.7).




Рис.7. Механизмы расщепления ДНК рестриктазами.

Реакция разрезания осуществляется в две ступени. Сначала разрезается одна цепь ДНК, а затем рядом разрезается другая. В областях, прилегающих с каждой стороны к сайту разрезания, может иметь место экзонуклеотическая деградация, когда фермент узнает один сайт, а разрезает другой, достаточно удаленный от первого. Это явление напрямую связано с «метилированием ДНК». Сайт-мишень может быть полностью метилирован (обе цепи модифицированы), полуметилирован (только одна цепь метилирована) или не метилирован.

Полностью метилированный сайт не подвержен ни рестрикции, ни модификации. Полуметилированный сайт не узнается ферментом рестрикции, но может быть превращен с помощью метилазы в полностью метилированный. У бактерий метилирование, как правило, связано с сохранением имеющегося состояния модификации. Репликация полностью метилированной ДНК ведет к образованию полуметилированной ДНК.

Неметилированный сайт-мишень представляет собой субстрат либо для рестрикции, либо для модификации in vitro. В клетке немодифицированная ДНК с большей вероятностью рестрицируется.

ДНК-полимеразы

ДНК-полимеразы обладают способностью удлинять цепь ДНК в направлении 5/→3/ путем присоединения комплемен-тарного нуклеотида. Впервые ДНК-полимераза была выделена Корнбергом с сотрудниками в 1958 году из E. Coli (Pol I). Фермент состоит из одной полипептидной цепи с молекулярной массой 109 кДа и имеет 3-х доменную структуру. Каждый домен обладает своей ферментативной активностью: 5/ - 3/ полимеразной, 3/ - 5/ экзонуклезной, 5/ - 3/ экзонуклеазной.

Известно, что при полимеразной реакции, катализируемой полимеразой, с определенной частотой возможно включение в растущую цепь и некомплиментарного нуклеотида, после чего дальнейший рост полинуклеотидной цепи останавливается. Полимераза не может присоединять нуклеотид к неправильно спаренному концу, образовавшемуся при ее участии. 3'—5' экзонуклеаза способствует вырезанию ошибочного нуклеотида, на место которого затем присоединяется правильный нуклеотид- предшественник. Таким образом, 3'—5' экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы играет важную роль в точности полимеризации, направляемой матрицей. 5'— 3' экзонуклеазная активность полимеразы способствует деградации одной цепи ДНК, начиная со свободного 5'-конца. В отличие от 3'—5' экзонуклеазы, 5'—3' экзонуклеаза расщепляет диэфирную связь только в спаренных участках двухцепочечной молекулы ДНК и может вырезать с 5'- конца олигонуклеотиды длиной до десяти остатков (около 20% продуктов гидролиза).

Такое сочетание ферментативных активностей позволяет ДНК-полимеразе-I E. coli играть активную роль в репарации повреждений ДНК in vivo.

В молекулярной биотехнологии наиболее часто исполь-зуются фермент ДНК-полимераза I, выделенная из E.Coli, а также термостабильная ДНК-полимераза – Taq-полимераза, выделенная из бактерий, живущих в горячих источниках (гейзерах). Taq-полимераза сыграла особо важную роль в разработке технологий полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Обратная транскриптаза или ревертаза

Обратная транскриптаза, или ревертаза - РНК-зависимая ДНК-полимераза, с помощью которого существляется  обратная транскрипция, т.е. синтез ДНК на РНК матрице. Ревертаза кодируется геномами некоторых РНК- содержащих вирусов и подвижных генетических элементов генома высших организмов, в генной инженерии с их помощью можно получить ген. Она используется для транскрипции мРНК в комплементарную цепь ДНК.

Фермент впервые открыт в 1970 г., когда Говард Темин с Сатоши Мизутани, а также независимо от них Дэвид Балтимор выделили искомый фермент в препарате внеклеточных вирионов вируса саркомы Рауса.

Обратная транскриптаза состоит из двух субъединиц с М.м. 65 и 95 кДа. и обладает тремя ферментативными активностями: 1) ДНК-полимеразной, использующей в качестве матрицы как РНК, так и ДНК; 2) активностью РНК-азы, гидролизующей РНК в составе гибрида РНК—ДНК; 3) ДНК-эндонуклеазной активностью. Первые две активности необходимы для синтеза вирусной ДНК, а эндонуклеазная, по-видимому, важна для интеграции вирусной ДНК в геном клетки-хозяина.

Чтобы начать синтез, ревертазе, как и другим полимеразам, необходим короткий двухцепочечный участок (праймер). Праймером может служить одноцепочечный фрагмент как РНК, так и ДНК. Обратную транскриптазу преимущественно используют для транскрипции матричной РНК в комплементарную ДНК (кДНК). Реакцию обратной транскрипции проводят в специально подобранных условиях с использованием сильных ингибиторов РНК-азной активности. При этом удается получать полноразмерные ДНК-копии целевых молекул РНК.

ДНК-лигазы

В 1957 г. молекулярные биологи Метью Мезелсон и Франклин Сталь исследуя механизмы репликации ДНК установили, что репликация ДНК имеет полуконсервативный механизм. Это означает, что каждая дочерняя спираль ДНК состоит из одной старой (материнской) и из одной вновь синтезированной цепи. Это положило начало поискам фермента, участвующего в сшивании фрагментов ДНК и в 1967 году такой фермент был найден и получил название ДНК-лигаза. Он катализирует синтез фосфодиэфирной связи в 2-х цепочечной молекуле нуклеиновой кислоты.

Создание фосфодиэфирных связей в одноцепочечных разрывах двухцепочечной ДНК с помощью ДНК-лигаз является наряду с рестрикцией одним из важнейших этапов получения рекомбинантных ДНК in vitro. ДНК-лигазы разделяют на два семейства в зависимости от механизма действия:

1. ATФ-зависимые лигазы;

2. NAD + - зависимые ДНК-лигазы.



Наибольшее применение в генно-инженерных исследованиях сегодняшнего дня находит ATФ-зависимая ДНК-лигаза бактериофага Т4. Т4-ДНК-лигаза осуществляет соединение фрагментов ДНК, обладающих комплементарными «липкими» или «тупыми» концами. Реакция идет в два этапа (рис.8). В первом этапе образуется комплекс фермент – АМФ, а во втором – остаток АМФ переносится на 5/-фосфатную группу концевого нуклеотида в точке разрыва ДНК.

Рис.8. Механизм действия Т4- ДНК-лигазы.



Нуклеазы

Нуклеазы – ферменты, гидролизующие молекулы нуклеиновых кислот. В результате действия нуклеаз молекула ДНК или РНК распадается на фрагменты или отдельные нуклеотиды. Различают ДНК-азы, гидролизующие ДНК, РНК-азы, гидролизующие РНК. Различают экзонуклеазы - гидролизуют 5/ или 3/ концевые фосфатные связи и эндонуклеазы – расщепляют внутренние связи полинуклеотидной цепи молекулы ДНК.

Некоторые нуклеазы гидролизуют избирательно только одноцепочечные молекулы (нуклеаза SI), только двухцепочечные молекулы ДНК (эндонуклеаза III) или гибридные ДНК-РНК-молекулы (рибонуклеаза H).

В молекулярной биотехнологии наиболее широко применяются экзонуклеаза III E.Coli, нуклеаза S1, панкреатическая рибонуклеаза А, панкреатическая дезоксирибонуклеаза I и др.

Экзонуклеаза III E. coli катализирует последовательное отщепление 5/- нуклеотидов ДНК. Фермент обладает также эндонуклеазной активностью по отношению к апуринизированной ДНК, активностью РНКазы H (гидролиз РНК в РНК-ДНК-гибридах) и 3/- фосфатазной активностью.

Нуклеаза S1 из Aspergillus orizae специфически расщепляет молекулы ДНК и РНК с образованием 5/- фосфорилированных моно- и олигонуклеотидов.

Панкреатическая рибонуклеаза A (РНКаза A) является небольшим белком, который обладает активностью эндорибонуклеазы, специфически расщепляющей фосфодиэфирные связи, образованные пиримидиновыми нуклеотидами.

Панкреатическая дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I) представляет собой эндонуклеазу, гидролизующую как одно-, так и двухцепочечную ДНК с образованием сложной смеси моно- и олигонуклеотидов, содержащих 5/-фосфатные группы.



4. Методы изучения генома

Секвенирование нуклеиновых кислот.

Секвенирование - определение нуклеотидной последовательности нуклеиновых кислот. Известны различные технологии секвенирования. Технологии ДНК-секвенирования зарождались благодаря работам Уолтера Гилберта и Фредерика Сенгера в 70-х годах прошлого века. С момента возникновения они перевернули человеческое понимание о биологии. В настоящее время секвенирование является важнейшей технологией в установлении функции отдельных генов. В процессе секвенирования генома организма исследователь получает информацию о всей ДНК, находящейся в хромосомах клеток. Эта информация включает количество и последовательности всех генов и некодирующих участков. В основе технологий секвенирования лежат различные стратегии, основанные на уникальных комбинациях приготовления ДНК-матриц, визуализации, а также выравнивания и составления нуклеотидных последовательностей.

Основным преимуществом современных методик секвенирования является рентабельность и экспресность. Существенный прогресс в технологиях за последние годы, в скором времени может привести к уменьшению стоимости секвенирования до 1000 долларов на индивидуальный геном. Биотехнологические компании уже сегодня предлагают индивидуальное секвенирование и генотипирование, а также информацию о персональной родословной. В ближайшем будущем пациенты смогут принести информацию о собственном геноме для того, чтобы врач смог оценить риски заболеваний и скорректировать стратегию лечения.



В настоящее время используют два основных метода – химический и ферментативный методы секвенирования.

Химическое секвенирование основано на избирательном разрушении нуклеотидов. Метод предложен в 1977 г. А.М.Максом и В. Гильбертом. Для секвенирования этим методом вначале получают одноцепочечную молекулу ДНК, один из концов которой метят с помощью радиоизотопа фосфора - 32Р. Препарат меченый ДНК делят на 4 порции и каждую порцию обрабатывают реагентом, специфически разрушающим азотистые основания. Так добавление 60% муравьиной кислоты разрушает пуриновые основания (аденин и гуанин), добавление диметилсульфата – только гуанидина, гидразин разрушает пиримидиновые основания (тимин и цитозин), под действием 1,5 М NaCl разрушается только цитозиновые основания. В результате получается набор меченых фрагментов, длины которых определяются расстоянием от разрушенного азотистого основания до конца молекулы. Фрагменты, образовавшиеся во всех четырех пробах, разделяют путем электрофореза в акриламидном геле, затем проводят радиоавтографию и по положению фрагментов, содержащих радиоактивную метку, определяют расстояние от меченого конца где находилось разрушенное основание. Метод Максима - Гельберта имеет ряд недостатков, а именно анализ является длительным и трудоемким.

Среди большого многообразия методик ферментативного секвенирования наиболее известным является метод Сэнгера предложенный в 1977 г. и получивший название метода терминирующих аналогов трифосфатов. Этот способ, несколько модифицированный, и в более мощном, более технологичном варианте применяется до сих пор. В основе метода лежит ферментативное клонирование ДНК, используя в качестве праймеров синтетические олигонуклеотиды.



Рис.9. Схема метода секвенирования по Сэнгеру.

Специфическую терминацию синтеза обеспечивает добавление в реакционную смесь помимо четырех типов нуклеозидтрифосфатов (один из которых радиоактивно мечен) и одного из 2',3'-дидезок-синуклеозидтрифосфатов, который способен включаться в растущую цепь ДНК, но не способен обеспечивать дальнейшее копирование из-за отсутствия 3'-ОН группы. В итоге удается получить набор копий ДНК различной длины. Для определения первичной структуры исследуемого фрагмента ДНК необходимо провести четыре реакции копирования: по одному типу терминаторов в каждой из реакций. После этого полученные продукты подвергаются электрофорезу в полиакриламидном геле на соседних дорожках и по расположению полос определяется последовательность нуклеотидов (рис.9).

Современные секвенаторы – это так называемые секвенаторы второго поколения (SGS, second generation sequencing). В них участки ДНК также по-прежнему многократно клонируются, но процесс чтения устроен не так, как у Сэнгера. Существует много разных методов, отличающихся довольно существенно.

1) Секвенирование лигированием (sequencing by ligation) - на фазе распознавания нуклеотидов используют не ДНК-полимеразу и процесс репликации, а специальные короткие «зонды», которые присоединяются к комплементарным нуклеотидам, фиксируются, затем вымываются, и процесс повторяется снова.

2) Пиросеквенирование (pyrosequencing) - основано на хемилюминесцентных сигналах, которые подают специально модифицированные нуклеотиды, когда соединяются с комплементарным нуклеотидом в прочитываемой нити ДНК.

3) Метод ионного полупроводникового секвенирования - детектирует соединения (ионы), которые выделяются при присоединении нового нуклеотида к нити ДНК.

Рестрикционный анализ.

Метод основан на способности ферментов рестрикции (рестриктазы) специфически расщеплять ДНК в определённых сайтах. Рестриктазы стали эффективным инструментом исследования нуклеиновых кислот. Они позволяют превращать молекулы ДНК в набор фрагментов длиной от нескольких сотен до нескольких тысяч оснований. Методом электрофореза в агарозном геле фрагментов ДНК, различающихся по размеру, можно легко разделить, а затем исследовать каждого по отдельности.

При электрофорезе короткие фрагменты мигрируют намного быстрее, чем длинные. При окрашивании гелей красителями, связывающимися с ДНК, выявляется набор полос, каждая из которых соответствует рестрикционному фрагменту.



Рис.10 Результаты электрофореза после обработки фрагмента ДНК разными рестриктазами.

Сравнение размеров фрагментов ДНК, полученных после обработки определенного участка генома набором рестриктаз, позволяет построить рестрикционную карту, на которой указано положение каждого сайта рестрикции относительно других участков.

Использование рестриктаз позволили разработать методы получения рекомбинантных молекул, генов, трансгенеза и решения проблем генной инженерии, способствовали разработке эффективных методов секвенирования ДНК.



Полимеразная цепная реакция.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов ДНК (клонирование) в биологическом материале.

Метод ПЦР относится к гибридизационным методам анализа ДНК, основанным на достраивании комплементарной полинуклеотидной цепи на одинарной полинуклеотидной цепи - матрице. Принцип метода ПЦР был разработан в начале 80-х годов прошлого столетия в США. В настоящее время метод широко используется в научных исследованиях, в практическом здравоохранении и службе Госсанэпиднадзора.



Основные стадии ПЦР

1) денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, расхождение нитей ДНК) при 94—96 °C.



2) отжиг при 68 °C, образование коротких двухцепочечных участков ДНК (затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК) или связывание нитей ДНК праймерами;

3) элонгация при 72 °C или синтез новой цепи ДНК (комплементарное достраивание обеих нитей);

4) окончание первого цикла. Две получившиеся ДНК-цепи служат матрицей для следующего цикла, поэтому количество матричной ДНК в ходе каждого цикла удваивается.

Таким образом, в основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов in vitro. В результате нарабатывается количество ДНК, достаточное для визуальной детекции.

Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом. Широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.





Рис.11 Схематическое изображение первого цикла ПЦР.

Разновидности ПЦР

• «Вложенная» ПЦР — применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.

• «Инвертированная» ПЦР — используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном.

• ПЦР с обратной транскрипцией — используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности из РНК. Предварительно проводят на матрице мРНК синтез одноцепочечной молекулы ДНК с помощью ревертазы, которая используется в качестве матрицы для ПЦР.

• Количественная ПЦР — используется для быстрого измерения количества определенной ДНК, кДНК или РНК в пробе.

• Количественная ПЦР в реальном времени — в этом методе используют флуоресцентно меченые реагенты для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления.

• ПЦР с использованием горячего старта — модификация ПЦР с использованием парафина для разделения верхней и нижней смесей с целью недопущения раннего смешивания компонентов реакции.

• RAPD PCR (Random Amplification of Polymorphic DNA PCR) - ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК — используется тогда, когда нужно различить близкие по генетической последовательности организмы. Например, разные сорта культурных растений, породы собак или близкородственные микроорганизмы.

Методы гибридизации.

Гибридизация ДНК, гибридизация нуклеиновых кислот - соединение in vitro  комплементарных одноцепочечных  нуклеиновых кислот из разных источников  в одну молекулу.

В 1961 году было обнаружено, что если комплементарные цепи ДНК, полученные после денатурации, выдержать при температуре 65°С, они легко спариваются, восстанавливая структуру двойной спирали (ренатурация). Подобные процессы могут происходить между двумя любыми одинарными цепями нуклеиновых кислот (ДНК—ДНК, РНК—РНК, ДНК—РНК) при условии, что они содержат комплиментарные последовательности нуклеотидов.

Если при гибридизации используются участки ДНК (РНК) с известной последовательностью нуклеотидов, то этот метод весьма эффективен для поиска неидентичных, но родственных генов в биопробах. Участки ДНК (РНК) с известной последовательностью нуклеотидов, меченые специальной меткой и используемые для гибридизации называются ДНК (РНК)-зондами. ДНК-зонды применяются в различных целях. Гибридизация ДНК-зонда с РНК, выделенной из анализируемой клетки, может выявить наличие или отсутствие экспрессии гена. Если гибридизации не происходит, значит, ген молчит, не работает. ДНК-зонды также позволяют проводить диагностику инфекционных и наследственных болезней. Методы гибридизации лежат в основе других более современных методов изучения нуклеиновых кислот.

Способность к гибридизации двух препаратов ДНК служит строгим тестом на комплементарность. Существуют два основных способа проведения реакции – это гибридизация в растворе и гибридизация на фильтре.



В случае гибридизации в растворе препараты одноцепочечной ДНК смешивают и отжигают непосредственно в растворе. Данный способ имеет существенный недостаток: цепи препарата ДНК могут одновременно ренатурировать с образованием гибридных, так и исходных двухцепочечных молекул ДНК. Поскольку обе реакции конкурируют между собой, то трудно с нить степень гибридизации.

Рис. 12. Способы гибридизации

Этот недостаток легко преодолеть, если один из препаратов ДНК иммобилизовать так, чтобы он не мог ренатурировать. Для этой цели используют нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтры (мембраны), на поверхности которых адсорбируют одноцепочечную ДНК. Затем фильтр с иммобилизованной ДНК инкубируют в растворе второго препарата ДНК, который обычно содержит метку (радиоактивную, флуоресцентную и т.п.). Гибридизация иммобилизованной ДНК и ДНК-зондов (т.е. ДНК, содержащей метку) происходит только в том случае, если их последовательности комплементарны. Анализ результатов гибридизации проводят по метке, оставшейся на фильтре. Этот способ гибридизации используется во многих методах криминалистического ДНК-анализа.

Гибридизация, как один из классических методов исследования нуклеиновых кислот лежит в основе многих других методов, таких как рестрикционный анализ, генная дактилоскопия, технологий филогенетического анализа и др.

В рестрикционном анализе, как известно, фрагменты ДНК различной длины могут быть фракционированы методом электрофореза. Для определения длины фрагментов ДНК на гель наносят ДНК или РНК зонды, т.е. пробу, содержащую смесь фрагментов известной длины. Ориентируясь на расположение зонда и полосы фрагмента ДНК неизвестного размера, устанавливают его длину.

Генная дактилоскопия

В настоящее время в криминальной практике широко стали использоваться геномные методы идентификации личности, созданные на базе достижений молекулярной генетики человека. Начало всему этому было положено англичанином А. Джеффрисом, разработавшим «дактилоскопирование» на основе молекулярного анализа ДНК (сейчас это называют ДНК-фингерпринтированием — от англ. слова finger — палец). Метод геномной дактилоскопии дал криминалистам абсолютно надежный тест на идентификацию личности. «Генные отпечатки» позволяют идентифицировать того или иного человека по небольшому количеству практически любого биологического материала (капли крови, одного волоса, слюны, кусочка ногтя, следов пота, спермы). Сообщалось, что разработаны методы, позволяющие проводить идентификацию личности даже по одной лишь клетке.



Суть метода геномной дактилоскопии заключается в том, что за основу берутся повторяющиеся участки генома - микросателлиты. На их основе были созданы зонды, позволяющие определять количество и расположение микросателлитов в геноме того или иного организма. Число и расположение микросателлитов в определенных местах генома для каждого человека строго индивидуально. Например, если в определенном месте нашей молекулы ДНК последовательность ТЦА повторена три раза подряд: ТЦАТЦАТЦА, то вероятность встретить на Земле второго человека, у которого в том же месте ДНК те же три нуклеотида практически исключена.

Рис.13. Молекулярный документ (ДНК-фингерпринт), отражающий длины микросателлита, свидетельствующий о родственных отношениях отца и матери с их детьми. Слева — строение кластеров одного из микросателлитов (ГГСАГГАГ) у родителей и детей, справа внизу — результат анализа длин микросателлитов, осуществленный с помощью электрофореза и гибридизации: все дети рождены этими родителями.

Процедура установления личности (типирования) состоит в следующем. Первоначально выделяют ДНК из любого биологического материала (кровь, сперма, кусочек кожи, волосяная луковица). Затем ДНК «нарезают» рестриктазами на фрагменты и подвергают электрофорезу, в результате чего фрагменты выстраиваются в ряд строго по размеру. Далее проводят гибридизацию с использование зонда приговленного на основе микросателлитного ДНК. Расположение связывающихся с зондом (гибридизующихся) фрагментов определяют методом радиоавтографии или флюоресценции, в зависимости от характера метки зонда. В любом случае в итоге получают «картинку» внешне чем-то напоминающую штриховые коды на упаковках товаров в магазинах.

Нокаутирование генов

Нокаут гена (англ. gene knockout) – это метод молекулярной генетики, при котором из организма удаляют или делают неработоспособным определенные гены. Является одним из наиболее важных приемов изучения функций генов и белков. С помощью удаления или повреждения специфического гена можно получить ценную информацию о его роли в экспрессии определенного белка. Нокаутирование генов позволяет определить, какие изменения происходят в организме в результате отсутствия изучаемого белка. Нокаутные организмы помогают узнать функции генов, нуклеотидная последовательность которых известна. Различия между нокаутным и нормальным организмом могут свидетельствовать о функции выключенного гена.

В настоящее время созданы большое количество линий мышей с нокаутированными генами, которые используются для изучения процессов регуляции экспрессии генов, репарации (восстановления после повреждения) ДНК и развития опухолей.

Созданы экспериментальные животные модели болезни Альцгеймера, процесса старения, рака, диабета, ожирения, сердечно-сосудистых аутоиммунных и многих других заболеваний.

Для получения животных с нокаутированным геном широко используют метод РНК-интерференции.

РНК-интерференция (англ. RNA interference, RNAi) - процесс подавления экспрессии гена на стадии транскрипции или трансляции путем деградации мРНК при помощи малых молекул двухцепочечной РНК (dsРНК).

Суть механизма РНК-интерференции заключается в том, что при введении в клетки короткой двунитевой РНК она способна вызывать специфическое разрушение той мРНК, с которой имеет гомологию. Сначала dsРНК разрезается специальным ферментом DICER (рибонуклеаза IΙI типа) на короткие фрагменты размером от 19 до 21 п.н. Полученные короткие молекулы dsРНК образуют специфический комплекс с определенными клеточными белками (РНК-белковый комплекс RISC) обладающей ферментативной активностью. В комплексе РНК содержится в однонитевой форме (малые интерферирующие РНК или siРНК). Благодаря активности RISC, siРНК соединяется с комплементарной последовательностью определенной мРНК, что является сигналом для "разрезания" последней ферментами комплекса. Образующиеся в результате этого короткие фрагменты мРНК уже не способны обеспечивать синтез полноценного белка. Таким образом, конструируя различные dsРНК можно подавлять синтез строго определенных белков в клетке, не изменяя при этом структуру кодирующих их генов.

Термин "РНК-интерференция" для феномена специфического подавления экспрессии генов при введении двухцепочечной РНК был предложен Andrew Fire ( 1998). К этому времени был уже подробно исследован механизм действия двухцепочечной РНК в клетках млекопитающих, приводящий к прекращению трансляции всех мРНК независимо от последовательности двухцепочечной РНК. В отличие от этого эффекта двухцепочечной РНК, РНК-интерференция предполагает специфическое нарушение экспрессии только тех генов, которые обладают достаточно большой степенью гомологии с введенной двухцепочечной РНК. В последующие годы эффективность РНК-интерференции была продемонстрирована у самых разнообразных беспозвоночных.

Уже сразу после открытия РНК-интерференция стала использоваться как мощный и удобный способ специфического подавления экспрессии генов. Одновременно начались исследования самого механизма РНК-интерференции с использованием как генетического, так и биохимического подходов.

Селективный эффект РНК-интерференции на экспрессию генов делает её полезным инструментом для исследований с использованием биокультур клеток и живых организмов. В настоящее время РНК – интерференция используется для крупномасштабных исследований в области молекулярной биологии, биохимии, биотехнологии. Так, например, РНК-интерференцию используют для систематического «выключения» генов в клетках и установления функций генов при изучении деления клетки.

Система РНК-интерференции играет важную роль в защите клеток от вирусов, паразитирующих генов (транспозонов), а также в регуляции развития, дифференцировки и экспрессии генов организма.

Учитывая избирательное подавление синтеза белка, на РНК-интерференцию возлагают большие надежды в борьбе с инфекционными болезнями. Так как, механизм деградации может быть направлен на любую информационную РНК - клеточную, бактериальную или вирусную.

В 2007 году Марио Капекки (Италия), Оливер Смитис (Англия) и сэр Мартин Эванс за «открытие принципов введения специфических генных модификаций в организм мышей посредством эмбриональных стволовых клеток» получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине. По сути это было изобретение метода нокаута генов. Этот метод, разработанный лауреатами в конце восьмидесятых годов, широко используется в современных генетических исследованиях для определения функций генов.

Метод нокаута генов позволяет получать линии нокаутных мышей (knock-out mice,) — мутантных мышей, у которых выключены определенные гены. Этот метод позволяет исследовать роль каждого конкретного гена в развитии организма и в его нормальной и патологической работе и изучать различные человеческие болезни, используя мышей в качестве модельных объектов. Выключенный ген приводит к тем или иным нарушениям. Характер этих нарушений позволяет судить о функциях данного гена. С тех пор как эта методика была разработана, ее применение позволило создать тысячи различных линий нокаутных мышей, из которых несколько сотен служат модельными объектами для изучения человеческих болезней, в частности заболеваний сердечно-сосудистой и нервной систем и злокачественных опухолей.

В основе метода лежит явление гомологичной рекомбинации - обмена соответствующими участками между парами гомологичных хромосом. Марио Капекки и Оливер Смитис независимо друг от друга изобрели способ выключения (нокаутирования) генов за счет гомологичной рекомбинации с участием искусственно синтезированных фрагментов ДНК, имеющих определенную последовательность нуклеотидов, соответствующую участку одного из генов, но некоторым образом видоизмененную. Такие фрагменты вводят в  выращиваемые в культуре (in vitro) клетки посредством электропорации. За счет рекомбинации в некоторых из клеток культуры введенная последовательность внедряется в хромосому на место нормальной.

Если видоизменить внедряемую последовательность, то на основе испорченного таким образом гена, у получивших этот ген клеток будет синтезироваться нефункциональный белок или вообще не будет синтезироваться никакого белка. Капекки и Смитис научились выключать с помощью этого метода гены в культурах клеток, но разработанная ими технология не позволяла получать нокаутные многоклеточные организмы. В этом отношении продолжателем их работ был Мартин Эванс, который разработал способ выращивания в культуре эмбриональных стволовых  (недифференцированных) клеток мышей и впоследствии изобрел метод, позволяющий передавать определенные гены потомству мышей.

Достижения Эванса сделали возможным создание мышей, у которых определенный ген был бы выключен посредством нокаутирования за счет гомологичной рекомбинации с участием искусственно синтезированных фрагментов ДНК, т.е. нокаутируя гены в инъецируемых в эмбрион стволовых клетках.

Применение метода нокаута генов стало особенно актуальным в последние годы, после завершения секвенирования геномов как человека, так и мыши, а также ряда других видов животных. Последовательно нокаутируя различные гены в пределах мышиного генома, исследователи выясняют функции каждого из них. Учитывая, что у человека и мыши очень многие гены сходны и выполняют одни и те же функции, нокаутные мыши предоставляют исследователям богатый материал для изучения роли генов в нормальном развитии и жизни человеческого организма и в патологических процессах. По-видимому, рано или поздно благодаря методу нокаута генов удастся изучить свойства всех (нескольких десятков тысяч) генов мышиного генома. Работы в этом направлении ведутся во многих странах мира, в т.ч. и в России.



Поделитесь с Вашими друзьями:
1   2   3   4   5   6   7


База данных защищена авторским правом ©grazit.ru 2017
обратиться к администрации

    Главная страница