Учебное пособие Якупов Т. Р. Молекулярная биотехнология Биоинженерия Казань 2016



страница4/7
Дата02.06.2018
Размер4,31 Mb.
1   2   3   4   5   6   7

5. Методы генодиагностики и генотерапии

Генодиагностика - новая область в биологии, использующая молекулярно-генетические методы для выявления предрасположенности к болезни, ранней диагностики, выбора профилактики, медикаментозного лечения и индивидуального подхода к больному. Генная диагностика имеет большое будущее в экспресс-диагностике инфекционных болезней. На ранних этапах инфекции, когда антитела в организме ещё не выработаны, диагностика основана на идентификации антигена, в том числе специфических генов возбудителя.

Развитию генодиагностики способствовали успехи про-


граммы "Геном человека" и исследований молекулярных основ патологий живых организмов.

С целью генодиагностики производят исследование белка, РНК и ДНК. Основной объект исследований - ДНК.

Основные методы генодиагностики: гибридизация и электрофорез, полимера́зная цепна́я реа́кция (ПЦР) и их разновидности, о которых было сказано выше.

В настоящее время возникла индустриальная молекулярная биология, в которой применение компьютерных технологий является необходимым условием. Оказалось, что прогресс биотехнологии невозможен без разработки специализированных аппаратных, алгоритмических и программных средств (биоинформатика).

Современная экспериментальная техника позволяет создать анализирующую матрицу (биочип) размером несколько сантиметров, при помощи которой можно получить данные о состоянии всех генов организма.

Биологические микрочипы — это совокупность ячеек, расположенных на поверхности стекла или пластика, своего рода миниатюрный аналог сразу нескольких сотен, а то и тысяч реакционных пробирок.

Биологические микрочипы или, как их чаще называют — DNA microarrays (организованное размещение молекул ДНК на специальном носителе) — это один из новейших инструментов биологии и медицины 21 века. Микроскопический размер биочипа позволяет размещать на небольшой площади огромное количество разных молекул ДНК и считывать с этой площади информацию о тысячах различных генетических дефектов, онкогенов, белков и небелковых метаболитов, аллергенов и т.д., что открывает фантастические возможности для генетической диагностики и развития геномной медицины будущего.

Технологии изготовления чипов могут быть разными. Биочипы по природе нанесенного на подложку материала делятся на «олигонуклеотидные», когда наносятся короткие фрагменты ДНК, обычно принадлежащие к одному и тому же гену, и биочипы на основе ДНК, когда наносится длинные фрагменты генов (длиной до 1000 нуклеотидов).

Наиболее популярны в настоящее время биочипы на основе кДНК (комплиментарная ДНК), ставшие по-настоящему революционной технологией в биомедицине.



Молекулы ДНК каждого типа в достаточном количестве копий амплифицируются. Этот процесс может быть автоматизирован, для чего используется специальный робот - умножитель. Полученный генетический материал наносится в заданную точку на стекле («печать») и химически пришивается к стеклу (иммобилизация).

Рис. 14 Схема изготовления матричного биочипа с иммобилизованными зондовыми макромолекулами.

Принцип работы биочипов основан на биохимической реакции, в процессе которой один или несколько образцов ДНК или РНК, полученные из клеток, ткани или органа, метятся одним или несколькими флуоресцентными красителями и гибридизируются с материалом, напечатанным на биочипе.

После того как флуоресцирующие образцы прореагировали с биочипом, чип сканируют лазером, освещая поочередно точки нанесения ДНК каждого конкретного типа и следя за интенсивностью сигнала флуоресценции.

Возможности применения биочипов безграничны. Например, ученые из в Хельсинки используя чипы попытались выяснить, какие гены меняют свою активность под влиянием радиосигнала с частотой 900 МГц, который дают сотовые телефоны. Человеческие клетки из первичного подкожного слоя были выдержаны в культуре под этим сигналом в течение одного часа, после чего РНК из этих клеток и из клеток контрольной серии была пущена в качестве пробы на чип. В результате установили, что в таких условиях резко меняется активность генов «стресс-ответа».

ДНК-микрочипы широко используются для идентификации генов и их мутаций, связанных с различными заболеваниями; наблюдения за активностью генов; диагностики инфекционных заболеваний и определения наиболее эффективного метода антибиотикотерапии; скрининга микроорганизмов.

Биочипы, в отличие от технологий ПЦР в реальном времени или масспектрометрии, позволяют анализировать множество мутаций у одного человека одновременно, и являются удобной и универсальной технологией для массовых исследований генетического полиморфизма и скрининга мутаций. Именно это преимущество особенно важно для персонифицированной медицины будущего. Уже сейчас все чаще в различных областях медицины используются данные о геноме конкретного человека. Преимущества технологии ДНК-микрочипов:

- высокая точность и воспроизводимость.

- низкая себестоимость.

- возможность мультиплексности.

В настоящее время мы являемся свидетелями возникновения нового метода получения и использования информации о живой природе. Данные будут собираться автоматически и на промышленной основе. Развиваются компьютерные технологии, разрабатываются приборы-роботы, которые в автоматическом режиме будут осуществлять подбор биологического материала, подготовку, постановку и интерпретацию биологического эксперимента, а также формулировку наиболее вероятного решения поставленной задачи. На долю исследователя останется только тестирование полученных результатов и выработка инструкций для применения полученного нового знания в медицине или биотехнологии.

Генная терапия — метод лечения заболеваний, основанный на переносе в клетки организма определённых генов. Основная проблема генной терапии - разработка эффективного и безопасного способа переноса необходимых генов в дефектные клетки организма. В качестве «средств доставки» генов используют различные векторы, наиболее часто - различные вирусы (см. в разделе «Генетический вектор»). В настоящее время разработки генной терапии касаются только соматических клеток.

14 сентября 1990 г. была проведена первая успешная попытка коррекции генных дефектов при наследуемом Т-клеточном иммунодефиците, связанном с недостаточностью фермента аденозиндезаминазы. Двум больным девочкам провели пересадку собственных Т-лимфоцитов, в которые был внесён трансген — нормальный ген недостающего фермента. В результате нескольких проведённых инфузий у обеих пациенток наступило полное выздоровление. В настоящее время несколько тысяч больных несут в своём организме клетки, генетически изменённые искусственным путём.

Таким образом лечение заболеваний с помощью генов получило название генотерапии. Сейчас в мире насчитывается более 400 проектов, посвященных лечению с помощью генотеропии.

Разработке программы генной терапии предшествуют тщательный анализ тканеспецифической экспрессии соответствующего гена, идентификация первичного биохимического дефекта, исследование структуры, функции и внутриклеточного распределения его белкового продукта, а также биохимический анализ патологического процесса. Все эти данные учитываются при составлении соответствующего медицинского протокола.

Концепция генной терапии существует уже на протяжении последних десятилетий. Она заключатся в том, что наиболее радикальным способом борьбы с разного рода заболеваниями, вызываемыми изменениями геноме клеток, должна быть обработка, направленная непосредственно на исправление или уничтожение самой генетической причины заболевания, а не ее следствий.

Существует два типа генотерапии: заместительная и корректирующая.

Заместительная генотерапия заключается во вводе в клетку неповрежденного гена. Внесенная копия заменит по функциям сохранившийся в геноме больного дефектный ген. Все проводимые сегодня клинические испытания используют внесение в клетку дополнительных количеств ДНК.

При корректирующей терапии предполагается замена дефектного гена нормальным в результате рекомбинации. Пока этот метод на стадии лабораторных испытаний, так как эффективность его еще очень низка, но последние исследования показывают успехи в лечении некоторых заболеваний.

Существует несколько способов введения новой генетической информации в клетки млекопитающих. Используют два основных подхода, различающиеся природой клеток- мишеней:

- фетальную генотерапию, при которой чужеродную ДНК вводят в зиготу или эмбрион на ранней стадии развития. При этом ожидается, что введенный материал попадет во все клетки реципиента (и даже в половые клетки, обеспечив тем самым передачу следующему поколению);

- соматическую генотерапию, при которой генетический материал вводят только в соматические клетки и он не передается половым клеткам.

Есть и третий подход - активация собственных генов организма с целью полного или частичного преодоления действия мутантного гена. Яркий пример такого подхода - использование гидроксимочевины для активации синтеза гемоглобина F у больных с серповидноклеточной анемией.

В настоящее время во многих лабораториях молекулярной биотехнологии мира разрабатываются генетические препараты для лечения различных заболеваний.

Генетический препарат содержит фрагмент генетического материала, вводя которого в организм можно достичь того, что клетка, организм, считывая эту генетическую программу, начинают продуцировать необходимое лекарственное вещество.

Репарация ДНК

Репарация ДНК или генетическая репарация – процесс восстановления исходной нативной структуры ДНК, т.е. способность клеток исправлять химические повреждения и разрывы в молекулах ДНК.

Структура материального носителя наследственной информации - ДНК может нарушаться в результате действия как экзогенных (химических, физических и других агентов среды), так и эндогенных факторов (ошибки матричных процессов, действие ряда метаболитов и т.д.). Клетки всех живых организмов наделены еще и специальной системой защиты, направленной на восстановление повреждений ДНК, возникших в результате воздействия мутагенных факторов разной природы.

Идея о физиологичности мутационного процесса впервые была высказана еще в 1947 г. М.Е. Лобашевым. Впоследствии несколько исследователей независимо друг от друга предположили участие ферментных систем в восстановлении потенциальных повреждений. Так, изучая механизмы восстановления хромосомных разрывов, вызванных радиацией, Н.В. Лучник (1951 г), С. Вольф и К. Атвуд (1954 г.) впервые указали на существование в клетке специальной системы восстановления потенциальных повреждений. В 1958 г. В.И. Корогодин в экспериментах на диплоидных дрожжах открыл феномен восстановления клеточной жизнеспособности после воздействия рентгеновских и гамма-лучей и совместно с Н.В. Лучником предложил гипотезу, согласно которой непосредственным следствием облучения являются только потенциальные повреждения хромосом, т.е. предмутации.

Репарация ДНК — один из важнейших генетических процессов в клетке, обеспечивающих ее жизнеспособность и сохранение вида в целом. В настоящее время известно несколько механизмов генетической репарации. Одни из них более просты и «включаются» сразу же после повреждения ДНК, другие требуют индукции большого числа ферментов, и их действие растянуто во времени. Существуют системы, работающие как до, так и после фазы клеточного деления.

Главный «поставщик» ошибок в нуклеотидной последовательности - репликация ДНК. Длина ее молекулы у человека составляет более 3 млрд. нуклеотидов. Нарушения в первичной структуре ДНК могут быть обусловлены:

• ошибками спаривания - азотистые основания в матричной цепи ДНК в течение короткого времени может находиться в другой таутомерией форме приводящей к встраиванию аденина вместо цитозина с образованием AГ или ГА пар;

• спонтанным отщеплением азотистого основания от цепи ДНК (например, депуринизация — отщепление пуринов);

• дезаминированием цитозина и превращением его в урацил;

• присоединением метильных или этильных групп к азотистым основаниям, что приводит к изменению свойств основания и к образованию неверной пары.

Наиболее распространенный тип повреждений ДНК - алкилирование гуанина. Образовавшийся при этом метилгуанин может связываться с тимином вместо цитозина, что приводит в следующем цикле репликации к транзиции - замене ГЦ на AT. Другой часто встречающийся вариант повреждения - дезаминирование 5-метилцитозина, что также ведет к транзиции - замене ГЦ на AT. Кроме метильных или этильных групп, к основаниям способны присоединяться и более крупные химические группы. Они также препятствуют нормальному протеканию, как репликации, так и транскрипции.

Повреждения ДНК могут индуцироваться и внешними воздействиями: ультрафиолетом, рентгеновскими лучами, химическими соединениями и т.д. Например, УФ-облучение вызывает сшивку соседних тиминовых оснований в цепи ДНК. Образующиеся при этом тиминовые димеры препятствуют к нормальной репликации.

Воздействие рентгеновского излучения, может вызывать одноцепочечные разрывы. Более жесткие излучения приводят к образованию двухцепочечных разрывов ДНК.

Многие из этих повреждений исправляются особыми механизмами клетки - системами генетической репарации, имеющими для жизни организма и вида в целом чрезвычайно важное значение. В результате жесткого контроля и давления отбора они не менее сложны и совершенны, чем системы репликации и транскрипции. С позиций молекулярного механизма, повреждения в молекулах ДНК могут быть устранены тремя путями: прямым возвращением к исходному состоянию; вырезанием поврежденного участка и заменой его нормальным; рекомбинационным восстановлением в обход поврежденного участка.



По отношению к процессу репликации различают два основных типа репарации ДНК: дорепликативную (включающую фотореактивационную и эксцизионную формы, направленные на вырезание поврежденных участков ДНК) и пострепликативную (осуществляемую с помощью механизмов, участвующих в процессах рекомбинации и репликации ДНК).

Рис.15. Схема реконструкции ДНК, в которой разорваны обе цепи

Репарация может осуществляться как конститутивно с помощью специфического набора ферментов, постоянно присутствующих в нормально функционирующих клетках или путем активации группы генов, контролирующих различные клеточные функции, так называемая SOS-репарация.

В 2015 году за исследование механизмов репарации ДНК Томас Линдаль (Шведция), Пол Модрич и Азиз Санджар (США) были удостоены Нобелевской премии.

Томас Линдаль одним из первых доказал, что ДНК чрезвычайно подвержена различным повреждениям и если бы она не исправлялась, то развитие жизни на Земле было бы невозможным. Он расшифровал механизм эксцизионной репарации - когда вырезаются поврежденные участки и заменяются нормальными. 

Азиз Санджар обнаружил другой механизм — вырезание нуклеотидов. Клетки используют этот механизм для восстановления повреждений, наносимых ультрафиолетовым излучением.  

Пол Модрич нашел способ, с помощью которого клетки исправляют ошибки в ДНК в процессе деления - репарация ошибочно спаренных оснований. Происходит когда в одной цепи ДНК пропущено основание, а в другой - нет. Он уменьшает частоту ошибок в ДНК примерно в тысячу раз.

6. Алгоритм создания генно-инженерного продукта.

Генная инженерия – технология рекомбинантных ДНК. Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные объединением in vitro (в пробирке) двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников.

Получение рекомбинантных ДНК состоит из нескольких этапов:

1. выделение нужного (целевого) гена;

2. встраивание его в генетический элемент, способный к репликации (вектор);

3. введение вектора в организм-реципиент;

4. идентификация (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели желаемый ген или гены.
Получение генов

Выделение генов – один из главных этапов в генетической инженерии. В принципе существует два основных способа получения гена: синтез и выделение из ДНК.

Синтез гена осуществляется 2-мя путями – химико-ферментативный синтез и синтез с помощью обратной транскриптазы.

Химико-ферментативный синтез гена.

Впервые химико-ферментативный синтез гена был осуществлен в конце 60-х – в начале 70-х годов XX века индийским ученым Н.Кhorana, работавшим в США и который был удостоен Нобелевской премии в 1968 г. Корана вместе со своими сотрудниками синтезировал ген одной тРНК, состоящей из 150 нуклеотидных пар.

Химико-ферментативный синтез генов выполняется в двух стадиях: 1) химический синтез коротких, состоящих из 8-16 нуклеотидов одноцепочечных фрагментов ДНК - олигонуклеотидов. Это осуществляется поэтапным образованием фосфодиэфирных связей между нуклеотидами; 2) полученные олигонуклеотиды сшиваются между собой с помощью фермента ДНК-лигазы. Из одноцепочечных олигонуклеотидов формируют двухцепочечную цепь ДНК.

Первичная структура олигонуклеотидов определяется либо по известной последовательности оснований в гене, либо по методу «чтения с листа». В этом случае за основу берется последовательность аминокислот в нужном белке и по ней с помощью таблицы генетического кода записывается последовательность нуклеотидов в гене. Структуру олигонуклеотидов выбирают так, чтобы они частично были комплементарны друг с другом.

Сшивание полученных олигонуклеотидов с помощью ДНК-лигазы осуществляется путем последовательного добавления их в реакционную смесь с определенной ионной силой и температурой.

Химико-ферментативный синтез ДНК используют не только для полного синтеза структурных генов, но и для присоединения к ним регуляторных участков (промоторов, участков связывания РНК с рибосомой), а также последовательностей, необходимых для соединения полученных генов с векторными молекулами.

Данный способ является трудоемким и весьма сложным. Преимуществом его являются то, что позволяет точно воссоздать необходимую последовательность нуклеотидов, кроме того, в процессе синтеза можно ввести различные регуляторные последовательности или участки узнавания различных рестриктаз и т. д. Этим методом получены гены соматостатина, А- и В- цепи инсулина, проинсулина и другие гены.



Синтез генов с помощью обратной транскрипции

Используя реакцию обратной транскрипции, при помощи ферментов ревертаз (обратные транскриптазы), можно синтезировать практически любой ген в присутствии соответствующих мРНК. Методы выделения последних достаточно хорошо разработаны.



Данный метод основан на универсальной способности обратных транскриптаз синтезировать двунитевую ДНК на однонитевых РНК-матрицах. Функционирование обратных транскриптаз нуждаются лишь в наличии короткой затравочной олигонуклеотидной последовательности РНК или ДНК, комплементарной РНК – матрице (затравка – праймер). Основное требование к затравке - присутствие на ее 3'-конце свободной ОН-группы, с помощью которой фермент инициирует обратную транскрипцию.

Промоторные и другие регуляторные участки гена достраиваются к ДНК-копии с помощью химико-ферментатив-ного синтеза. Таким образом получены гены, кодирующие синтез белка хрусталика глаза человека, яичного белка и др.

Выделение гена из ДНК

Выделение генов из естественных источников является сложнейшей задачей, так как из многих тысяч генов, имеющихся в геноме клетки, нужно выделить единственный конкретный ген, контролирующий развитие того или иного признака. Для этого необходимо точно знать расположение гена и произвести его вырезание при помощи соответствующих ферментов.

Рестриктазы — это абсолютно необходимый и единственный своего рода инструмент в генной инженерии для вырезания интересующих фрагментов (генов) из больших молекул ДНК. Поскольку известно более 100 ферментов рестрикции, то это позволяет выбор рестриктаз и селективное вырезание фрагментов из исходной ДНК.

Выделенный или синтезированный ген не может самостоятельно встраиваться в ДНК клетки-мишени и тем более начинать функционировать. Для переноса целевого гена создается специальная конструкция - вектор, несущий полученный ген и способный встраиваться в геном клетки.



Генетический вектор

Генетический вектор – это молекула ДНК или РНК, которые способны переносить в клетку чужеродную ДНК, обеспечить её амплификацию и интеграцию в геном.

По профилю использования векторы бывают:

1. Векторы для клонирования – используются для амплификации фрагмента ДНК, встроенного в вектор посредством её репликации.

2. Экспрессионные векторы – для наработки определенного белка, а также для анализа генома и его продуктов.

3. Векторы для трансформации – для введения чужеродного фрагмента ДНК в геном реципиента.

Требования векторам:

Вектор должен быть небольшим и содержать сайты рестрикции для нескольких рестриктаз, должен обладать определенной емкостью; быть способным поддерживаться в клетке-хозяине (реплицироваться), многократно копироваться (ампфлицироваться), экспрессировать соответствующий ген (содержать соответствующие регуляторные последовательности); должен иметь маркерный ген, позволяющий различать гибридные клетки для эффективной селекции; должен быть способным передаваться в клетку соответствующего организма.

В настоящее время широко применяются, в качестве прокариотических векторов - плазмиды, бактериофаги, а в качестве эукариотических - вирусы животных и растений, а также искусственно сконструированные векторы, способные реплицироваться как в бактериальных, так и в эукариотических клетках (челночные векторы).

Плазмиды - это внехромосомные генетические элементы про- и эукариот, которые автономно реплицируются в клетках.

Бактериальные плазмиды делятся на два класса. Одни плазмиды (например, хорошо изученный фактор F, определяющий пол у E.coli) сами способны переходить из клетки в клетку, другие такой способностью не обладают. По ряду причин, и прежде всего для предотвращения неконтролируемого распространения потенциально опасного генетического материала, подавляющее большинство бактериальных плазмидных векторов создано на основе плазмид второго класса.



Как правило они состоят из факторов переноса и тех или иных детерминантов фенотипических свойств бактерий (лекарственной, резистентности, токсичности и т. д.). К настоящему времени плазмиды обнаружены во многих микроорганизмах. Они образовались в результате процесса, который можно назвать «блочной» эволюцией. При этом различные гены объединяются с репликоном, образуя более сложную струк­туру.

Клеточная организация природных плазмид и дала основание для разработки методов конструирования плазмидных векторов в лабораторных условиях. Оказалось, что плазмиды могут быть «разобраны» и «собраны» по заданной программе с помощью рестриктаз и лигаз, аналогично тому, как это происходит в природе.

Важнейшим компонентом вектора является его репликон - элемент, от которого зависит автономное размножение вектора в клетке-хозяине. Чтобы получить плазмидный вектор, необходимо объединить репликон с генами, которые допускали бы возможность селекции (генетические маркеры). Гены, кодирующие резистентность к антибиотикам, оказались наиболее полезными для этой цели.

Современные плазмидные векторы имеют обычно два маркера резистентности. Например, в векторной плазмиде рВР 322 имеются маркер резистентности к ампициллину и маркер резистентности к тетрациклину.


Рис.16. Плазмидный вектор E.coli – pBR 322.
Бактериальные клетки, содержащие такой вектор, устойчивы одновременно к ампициллину и тетрациклину. При включении фрагментов ДНК в участок гена резистентности к тетрациклину, устойчивость к тетрациклину из-за этой вставки нарушается, и все рекомбинантные плазмиды сохраняют устойчивость только к ампициллину. Таким образом, высевая клетки на среды с антибиотиками, можно отобрать клоны, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК.

На рис. 16 показан один из самых распространенных плазмидных векторов E.coli - pBR322. Особенность плазмиды состоит в том, что в присутствии ингибитора синтеза белка антибиотика хлорамфеникола (опосредованно ингибирующего репликацию хозяйской хромосомы) ее число в E.coli возрастает от 20-50 до 1000 молекул на клетку, что позволяет получать большие количества клонируемого гена.

Плазмидный вектро pBR322 – это наиболее универсальный вектор 80-х годов. Название формируется так:

p – плазмида

BR – фамилии авторов: Bolivar, Rodriges

322 – число, взятое из их исследовательских протоколов.

Длина плазмиды 4361 п.н., она имеет 2 гена устойчивости к антибиотикам: ампициллину (Ampr), тетрациклину (Tetr), а также сайты для рестриктаз:

- BamHI (Bacillus amyloliquefaciens H)

- HindIII (Haemophilus influenzae d)

- SalImonella (Streptomyces albus)

- PstI (Providencia stuartii)

- EcoRI (E.Coli) (Escherichia coli).

Плазмидные векторы удобны для клонирования относительно небольших фрагментов (до 10 тыс. пар оснований) геномов, т.е. плазмидные вектора обладают небольшой емкостью. Если же требуется получить клонотеку (или библиотеку) генов высших растений и животных, общая длина генома которых достигает огромных размеров, то обычные плазмидные векторы для этих целей непригодны. Проблему создания библиотек генов для высших эукариот удалось решить с использованием в качестве клонирующих векторов производных бактериофаг.



Бактериофаги - группа вирусов, паразитирующих в бактериальных клетках. Они широко распространены в природе — их выделяют из воды, почвы, организмов различных животных и человека.

Принципы классификации бактериофагов аналогичны подходам к систематике вирусов. В основу классификации положены антигенная структура, морфология фагов, спектр действия, химический состав и др. Большинство фагов относится к ДНК-содержащим вирусам с нуклеокапсидом, организованным по принципу смешанной симметрии.



По спектру действия выделяют типовые фаги (Т-фаги) - лизирующие бактерии отдельных типов внутри вида, моновалентные фаги - лизирующие бактерии одного вида, и поливалентные фаги - лизирующие бактерии нескольких видов.


Рис. 17. Схема строения бактериофага

Среди фаговых векторов наиболее удобные системы созданы на базе геномов бактериофага λ и М13 E.coli. ДНК этих фагов содержит протяженные области, которые можно заменить на чужеродную ДНК, не затрагивая их способности реплицироваться в клетках E.coli. При конструировании векторов на базе ДНК фага из нее сначала (путем делений коротких участков ДНК) удаляют многие сайты рестрикции из области, не существенной для репликации ДНК, и оставляют сайты, предназначенные для встраивания чужеродной ДНК. В эту же область часто встраивают маркерные гены, позволяющие отличить рекомбинантную ДНК от исходного вектора.

На основе бактериофага λ можно сконструировать векторы емкостью до 25 т.п.н.

Существуют гибридные вектора, содержащие ДНК фага и плазмиды. К ним относятся, например, космиды и фазмиды.

Космиды – плазмидные вектора, в которые встроен участок генома фага λ, обеспечивающий возможность упаковки этой молекулы ДНК в фаговую частицу. Фаговые частицы обеспечивают хорошее проникновение гибридной ДНК в клетку (путем инъекции), после чего происходит замыкание ДНК в кольцо по липким концам и репликация ее по плазмидному типу.

Фазмиды также являются гибридами между фагом и плазмидой. После встройки чужеродной ДНК могут в одних условиях развиваться как фаги, в других – как плазмиды.

Основными компонентами космидного вектора являются: 1) плазмидный репликон, 2) маркер резистентности к антибиотику, 3) фрагмент ДНК фага λ, который содержит так называемый COS – участок или липкие концы, репликон, маркер антибиотикорезистентности.

Плазмиды, содержащие фаговые и бактериальные регуляторные элементы, были использованы для синтеза гормона роста человека, инсулина, интерферона и ряда других белков.

Основная проблема при разработке векторов — преодоление иммунологического барьера реципиента, ограждающего организм от различных внешних воздействий, в том числе и от внедрения чужеродной ДНК в геном клеток. В этом плане особый интерес представляют вирусы, так как из всех известных агентов лишь они способны более или менее успешно интегрировать генетический материал в геном клеток человека. Поэтому все усилия специалистов генной терапии на настоящий момент сконцентрированы в области генной инженерии вирусов, применяемых в качестве векторов, доставляющих терапевтические гены в клетки организма больного.



Векторы на основе РНК-содержащих вирусов

РНК содержащие вирусы, или ретровирусы (Retroviridae) легко интегрируют в геном клетки-хозяина, тем самым обеспечивая долговременную экспрессию необходимого гена. Для создания генно-терапевтических векторов они считаются наиболее перспективными.



Ретровирусы - обширное семейство вирусов, заражающих преимущественно позвоночных. Это вирусы, которые, как и другие вирусы, для собственного размножения используют сложную молекулярную и надмолекулярную систему жизнеобеспечения клетки, заставляя ее подчиняться своим регуляторным сигналам.

Рис. 18. Вирусы, применяемые для создания терапевтических векторов. 

Геном ретровирусов представлен однонитчатой РНК с молекулярной массой 7 мегадалътон и состоит из двух копий, каждая из которых является полноценным геномом и содержит одинаковую генетическую информацию, однако неизвестно, обе ли они функциональны.

Попадая внутрь клетки, ретровирусная РНК превращается в ДНК путем хорошо теперь известного процесса обратной транскрипции. Эта ДНК встраивается в геномную ДНК и с этого момента становится неотъемлемой частью генома клетки. А вирус становится провирусом.

Таким образом, инфицирование организма ретровирусами – это своего рода естественно-природный механизм генетической модификации клетки.

Ретровирусы относительно безвредны для человека, исключая, конечно, ВИЧ и Т-лимфотропные вирусы человека. Наиболее часто в качестве вектора применяют вирус лейкемии мышей. При разработке векторов из их состава полностью исключают гены, кодирующие синтез продуктов, обеспечивающих репродукцию. Кодирующая ёмкость трансгенов в составе ретровирусных векторов не превышает 8000 пар нуклеотидов.

Основные преимущества применения РНК-вирусных векторов — эффективная доставка генетического материала в клетки, поддержка долговременной экспрессии и трансдукция неделящихся клеток (большинство РНК-векторов неспособно к эффективному переносу трансгенов в покоящиеся клетки).

Векторы на основе ДНК-геномных вирусов

Векторы, созданные на основе ДНК-вирусов обладают большими размерами по сравнению с РНК-геномными вирусами и поэтому могут вмещать фрагменты ДНК (трансгены) длиной до 35 000 пар оснований.

С точки зрения переноса чужеродного ДНК в организм реципиента удобными оказались так называемые "челночные векторы", способные реплицироваться как в клетках животных, так и в клетках бактерий. Их получают, сшивая друг с другом большие сегменты вирусов животных и бактерий (например, SV40 и pBR322) так, чтобы районы, ответственные за репликацию ДНК, остались незатронутыми. Это позволяет проводить основные операции по конструированию вектора в бактериальной клетке, а затем полученную рекомбинантную ДНК использовать для клонирования генов в животной клетке.

Сверхъёмкие векторы

Исследование генов в хромосомах высших растений, животных и человека потребовало создания векторов для клонирования фрагментов ДНК длиной в несколько сотен тысяч пар оснований. Этим требованиям отвечает система для клонирования сверхдлинных молекул ДНК на основе искусственно полученной минихромосомы дрожжей YAC (yeast artificial chromosome). YAC-вектор представляет собой кольцевую молекулу ДНК, содержащую ряд генетических элементов, которые позволяют ей существовать во внехромосомном состоянии в клетках дрожжей. В таком векторе удавалось осуществлять клонирование фрагментов ДНК длиной до 700 т.п.н.

Для преодоления трудностей, возникающих при использовании искусственных хромосом дрожжей, были сконструированы альтернативные векторные системы, среди которых наиболее популярными в настоящее время являются системы, основанные на искусственных хромосомах бактерий – BAC (bacterial artificial chromosome).

В векторных системах BAC используется ДНК хорошо изученного полового фактора (F-фактора) E. coli – гигантской плазмиды мужских бактериальных клеток, которые являются донорами бактериальной ДНК при конъюгации с женскими клетками. Типичный F-фактор содержит гены oriS, repE, parA и parB, регулирующие его собственную репликацию и контролирующие число его копий в бактериальных клетках.

Современные BAC-векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК длиной до 300 т.п.н. и выше. Рекомбинантные молекулы вводятся в клетки E. coli с помощью электропорации, причем эффективность образования трансформантов до 100 раз выше, чем при обычной трансформации сферопластов дрожжей векторами семейства YAC.

Весьма существенным свойством системы клонирования, основанной на векторах семейства BAC, является ее генетическая стабильность. Исходная структура клонированных фрагментов ДНК в пределах точности использованных методов сохраняется в таких векторах даже после 100 серийных пересевов бактериальных клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК. Все вышеперечисленные свойства переводят векторы BAC в разряд сверхъемких векторов нового поколения.

Следующая группа сверхъемких векторов - векторы семейства PAC (P1- derived artificial chromosome), которые широко используются в современных исследованиях. Векторы этой серии содержат гены умеренного бактериофага Р-1, обеспечивающие репликацию фаговой хромосомы в зараженных бактериальных клетках. Рекомбинантные ДНК на их основе (размер вставки 150–200 т.п.н.) вводятся в бактериальные клетки с помощью электропорации. Отличительная особенность фага Р-1 в том, что поддерживает хромосому в цитоплазме бактериальных клеток в виде кольцевой ковалентно-замкнутой молекулы, напоминающей плазмиду, размер которой составляет 100 т.п.н. Размер репликона, который способен обеспечивать репликацию хромосомы P-1 составляет всего 1,5 т.п.н.

Искусственные хромосомы животных (MAC) и человека (HAC). При конструировании сверхъемких векторов такого рода используются разные методики – конструирование методом «сверху вниз» и методом «снизу вверх».

Стратегия конструирования MAC методом «сверху вниз»

основана на последовательном укорачивании природных хро-мосом с сохранением их элементов, обеспечивающих репликацию и митотическую сегрегацию. Эта группа методов известна как фрагментация хромосом, с использованием теломерных последовательностей (telomere-associated chromoso-me fragmentation – TACF) или укорачивание с помощью теломер (telomere directed truncation – TDT). Метод основан на гомологичной рекомбинации между вектором (YAC) и укорачиваемой хромосомой, в результате которой происходит замена большей части последовательностей плеч хромосомы на последовательности вектора. Такой вектор исходно содержит последовательности, гомологичные таковым изменяемой хромосомы, по которым происходит кроссинговер, селектируемый маркер (обычно ген устойчивости к антибиотику neo или gpt, кодирующий гуанинфосфорибозилтрансферазу) и теломерные последовательности.

При конструировании MAC методом «снизу вверх» искусственную минихромосому собирают из отдельных последовательностей, соответствующих теломерам, центромерам и областям начала репликации природных хромосом, с которыми объединяют требуемую рекомбинантную ДНК. Теломерные последовательности животных представляют собой тандемно повторяющиеся последовательности вида (TTAGGG) n , которые, будучи объединенными в повторы длиной ~1 т.п.н., эффективно функционируют в клетках человека. В качестве областей начала репликации могут быть использованы различные последовательности, среди которых наиболее изучены соответствующие последовательности β-глобинового гена человека.




Поделитесь с Вашими друзьями:
1   2   3   4   5   6   7


База данных защищена авторским правом ©grazit.ru 2017
обратиться к администрации

    Главная страница