Учебное пособие Якупов Т. Р. Молекулярная биотехнология Биоинженерия Казань 2016



страница7/7
Дата02.06.2018
Размер4,31 Mb.
1   2   3   4   5   6   7

4. Перепрограммирование соматических клеток

Клетки, выделенные из эмбрионов на стадии бластоцисты, могут пролиферировать в культуре, сохраняя способность к дифференцировке в любые типы клеток, в т.ч. и в клетки зародышевой линии, при введении в другой эмбрион на стадии бластоцисты. Такие клетки называются плюрипотентными эмбриональными стволовыми клетками (ES – клетки).

В 1999 году журнал «Science» признал открытие эмбриональных стволовых клеток третьим по значимости событием в биологии после расшифровки двойной спирали ДНК и программы «Геном человека». Стволовые клетки — это иерархия особых клеток живых организмов, каждая из которых способна впоследствии дифференцироваться особым образом, т.е. получать специализацию и далее развиваться как обычная клетка.

В различных органах и тканях взрослого организма существуют частично созревшие стволовые клетки, готовые быстро дозреть и превратиться в клетки нужного типа. Дифференцировку могут запускать как внутренние причины, так и внешние. Стволовые клетки таят в себе невиданные возможности: от регенерации поврежденных органов и тканей до лечения заболеваний, не поддающихся лекарственной терапии. Наиболее универсальными являются ES – клетки, основными характеристиками которых являются:

1. Тотипотентность — способность образовывать любую ткань организма.

2. Хоуминг — способность cтволовых клеток, при введении их в организм, находить зону повреждения и фиксироваться там, исполняя утраченную функцию.

3. Теломеразная активность.

4. Наличие в цитоплазме мРНК всех генов, которые отвечают за раннее развитие зародыша.



Хранилищем стволовых клеток организма служит костный мозг, где стволовые клетки находятся в своеобразной нише в окружении стромальных клеток, которые участвуют в передаче регуляторных сигналов.

Рис. 27. Родословное древо клеток крови.

Исследованиями в области молекулярной биотехнологии последних лет доказано возможность изменения процесса дифференциации клеток. Если до недавнего времени считали, что процесс развития оплодотворенной яйцеклетки происходит поэтапно с постепенной утратой полипотентности, то японский ученый Синья Яманака с соавторами (2006) установили возможность превращения дифференцированных клеток в стволовые, то есть в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) или IPS (induced pluripotenht stem cells).

Безусловно, это открытие стало величайшим достижением в клеточной инженерии, и не случайно, Синья Яманака в 2012 году был удостоен Нобелевской премии по физиологии и медицине.

Сегодня технология Яманаки дает возможность из специализированных клеток взрослого организма (чаще всего из фибробластов кожи) получать плюрипотентные клетки, наделенные возможностями развиваться в клетки разных тканей и органов. Для этого в них нужно внедрить четыре гена - Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc., которые обычно работают в эмбриональных стволовых клетках. Эти гены перепрограммируют клеточный геном, возвращая клетку в эмбриональную стадию и в последующем из них можно получить любой тип клеток. Так Д. Шриваставе получил сердечные миоциты из клеток кожи, а М.Вернига из клеток кожи нейроны (2010 г.) и др.

Технология отработана, но у нее есть недостатки: она довольно медленна и неэффективна для того, чтобы ее можно было использовать в практической медицине. О радикальном ее совершенствовании доложили ученые из Израиля под руководством доктора Якуба Ханна. Они совершили настоящий прорыв в технологии, добились того, что все исходные фибробласты стали превращаться в ИПСК. Этот прорыв чрезвычайно важен как для целей медицины, так и для лучшего понимания самого процесса перепрограммирования.

До сего времени перепрограммирование зрелых фибробластов в стволовые клетки занимало свыше 4-х недель. Сложность состоит еще и в том, что этот процесс происходит несинхронно в разных клетках. Наконец, выход конечного продукта, то есть ИПСК, не превышает 1%. Причина, не дающая клеткам эффективно менять свою судьбу, оказалась в одном белке под названием MBD-3.

Данный белок всегда присутствует в любой клетке на любой стадии ее развития, но до сих пор ученые не знали его функций. Как выяснили исследователи, единственное время, когда белка MBD-3 нет в клетке, это первые три дня после оплодотворения, то есть те самые первые дни развития зиготы, когда она начинает делиться, образуя бластулу и которая образована эмбриональными стволовыми клетками. Уже, начиная с четвертого дня развития, в клетках появляется белок MBD-3, и они постепенно утрачивают плюрипотентность и их развитие направляется по тому или иному пути. В дальнейшем клетки образуют три зародышевых листка — эктодерму, эндодерму и мезодерму. Биологи предположили, что именно белок MBD-3 противостоит плюрипотентности. Они удалили его из клеток, в результате скорость и эффективность их перепрограммирования резко повысились. Необходимое для этого время сократилось с четырех недель до восьми дней. Клетки начали испытывать превращение синхронно. И его эффективность приблизилась к 100%.



5. Моноклональные антитела.

Как известно, возникновение клеточной инженерии связано с разработкой технологий гибридизации соматических клеток. В настоящее время создание гибридомной технологии можно считать наиболее яркой страницей не только клеточной инженерии, но и молекулярной биотехнологии в целом. К этому времени усовершенствованы способы культивирования животных клеток и появились способы выращивания в культуре клеток и тканей растений.

Под клеточной инженерией в основном понимают метод конструирования клеток нового типа на основе их культивирования, гибридизации и реконструкции.

Культура клеток — метод сохранения жизнеспособности клеток вне организма в искусственно созданных условиях питательных сред. Для культивирования могут быть использованы клетки различных органов, лимфоциты, фибробласты, эмбрионы, клетки почек животных и человека, раковые клетки человека и т. д. Культуры, приготовленные непосредственно из тканей организма, называются первичными. В большинстве случаев клетки первичной культуры можно перенести из культуральной чашки и использовать для получения вторичных культур, которые можно последовательно перевивать в течение недель и месяцев.

Технология культивирования некоторых клеток животных настолько хорошо отработана, что может быть использована в производственных целях для получения различных продуктов. Они используются как медицинские препараты.

Одним из важнейших достижений гибридомной технологии является разработка методики получения моноклональных антител.

При введении антигена в организм возникает большое семейство различных антител, направленных к разным его детерминантам. Однако, иногда требуется только определённый вид антител, специфичных лишь к одной детерминанте антигена и имеющих одни и те же характеристики.

Моноклональные антитела – это антитела строго определённой специфичности, продукт одного клона клеток. Моноклональные антитела гомогенны как по специфичности, так и по физико-химическим свойствам. Моноклональное антитело связывается только с одной антигенной детерминантой на молекуле антигена. В природе почти никогда не наблюдается истинный моноклональный ответ.

Получение моноклональных антител стало возможным благодаря работам Георга Келера и Цезаря Мильштейна, которые в 1984 г. стали лауреатами Нобелевской премии.

Г. Келлер и Ц. Мильштейн получили гибридные клетки из лимфоидной опухоли (миелома) и нормального лимфоцита. Гибридные клетки имели часть хромосом нормального лимфоцита и часть - от опухоли. Следовательно, гибридома наследовала от нормальной клетки способность к синтезу антител, а от опухолевой клетки – способность к неограниченному числу делений.

Таким образом, гибридомная технология получения моноклональных антител - слияние лимфоцитов тканей (чаще сёлезенки) организмов, предварительно иммунизированных определенным антигеном, с раковыми клетками, способными к бесконечному делению.

Гибридомы - бессмертные клоны клеток лимфоидной ткани, синтезирующие моноклональные антитела.

Моноклональные антитела, продуцируемые одним клоном обладают следующими свойствами:

•  высокоспецифичны и специфичность направлена только к заданной антигенной детерминанте;

•  идентичны по аллотипу и идиотипу, а также по аффинности и физико-химическим характеристикам.



Стабильные культуры гибридом способны продуцировать моноклональные антитела в неограниченном количестве.

Рис. 28. Этапы получения моноклональных антител.

Благодаря своим уникальным свойствам моноклональные антитела успешно используются для решения многих актуальных задач биологии и медицины. Сегодня более 20% разрабатываемых биофармацевтических препаратов являются продуктами гибридомной технологии.

Получение и использование моноклональных антител — одно из существенных достижений современной иммунологии. С их помощью можно определить любое иммуногенное вещество:

1) антигены определяющие гистосовместимость и дифференцировку;

2) дифференцировочные, опухолевые и другие антигены клеточной поверхности, которые лишены полиморфизма и неиммуногенны в аллогенных системах, но распознаются при иммунизации;

3) вирусные и бактериальные антигены;

4) единичные антигенные детерминанты разнообразных белков, нуклеиновых кислот и др.

Моноклональные антитела можно использовать для диагностики рака и определения локализации опухоли, для диагностики инфаркта миокарда. Можно использовать моноклональные антитела для определения пола у крупного рогатого скота на предимплантационной стадии развития, а также для стандартизации методов типирования тканей при трансплантации органов, при изучении клеточных мембран, для построения антигенных карт вирусов, возбудителей болезней.

В медицине на основе моноклональных антител разработано большое количество диагностических систем для различных заболеваний (инфекционных, онкологических и др.), активно разрабатываются и лекарственные препараты например противоопухолевые препараты, антицитокиновые антитела и др.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Биотехнология – история становления как наука.

2. Молекулярная биотехнология – основные направления и их характеристика.

3. Генетическая инженерия – история развития, основные методы и объекты генной инженерии.

4. ДНК – как носитель генетической информации.

5. Ген, геном, структура генома.

6. Этапы реализации генетической информации в клетке.

7. Секвенирование ДНК. Метод Сенджера.

8. Ферменты генной инженерии. Рестриктазы. Особенности механизма действия.

9. Методы изучения генетического материала клетки. Рестрикционный анализ. Методы электрофореза. Методы гибридизации и др.

10. ПЦР. Основные принципы. Методика постановки.

11. Нокаутирование генов – как один из основных методов изучения генома.

12. Современные методы генодиагностики и генотерапии.

13. Молекулярные механизмы репарации ДНК.

14. Основные этапы получения рекомбинантных молекул ДНК.

15. Способы получения генов.

16. Генетический вектор. Виды и требования к генетическим векторам.

17. Методы внедрения вектора в клетку.

18. Основные классы генно-инженерных продуктов, значение для практической медицины и сельского хозяйства.

19. Генетическая инженерия растений. Основные этапы и её задачи.

20. Трансформация растений с помощью агробактерий.

21. Генетически модифицированные организмы. Способы их получения.

22. Методы идентификации ГМ-продуктов.

23. Значение ГМО в обеспечении населения продовольствием.

24. Клеточная инженерия – история развития, основные методы и объекты изучения.

25. Трансгенез. Способы получения трансгенных животных. Основные этапы.

26. Технология трансгенеза методом микроинъекций в пронуклеус.

27. Ретровирусные векторы в трансгенезе и их значение.

28. Антисмысловая РНК. Введение генов кодирующих антисмысловую РНК как новый подход в генной инженерии.

29. Клонирование – как способ создания новых организмов.

30. Способы и методы клонирования. Виды клонирования.

31. Стволовые клетки. Значение для молекулярной биотехнологии.

32. Перепрограммирование соматических клеток.

33. Получение гибридом – как достижение клеточной инженерии.

34. Моноклональные антитела. Технология получения.

35. Моноклональные антитела и их значение в иммунологии, клинической лабораторной практике и в других областях медицины.




РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА


  1. Абрамова З.И. Введение в генетическую инженерию. Учебное пособие для самостоятельной работы студентов. Казань. КФУ. -2008. – 168с.

  2. Вечканов Е. М., Сорокина И. А. Основы клеточной инженерии: Учебное пособие. Ростов-на-Дону. 2012. – 136с.

  3. Глик Б., Дж.Пастернак. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Москва «Мир». 2002.-589С.

  4. Тихонов И.В. Биотехнология. Санкт – Петербург. 2005.-792С.

  5. Шевелуха В.С. Сельскохозяйственная биотехнология. Москва, 2003.-469С.

  6. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. Новосибирск. – 2004.



Предметный указатель

Амплификация – 40, 66

Антисмысловая РНК – 97, 98, 114

Антитела – 86, 106, 126

- моноклональные – 86, 89,106, 125-127

Бактериофаг(и) – 70

Биоинженерия – 6, 107

Биотехнология – 3, 85, 106

Биочип – 52, 53, 55

Бластоцисты – 118, 122

Ген – 16, 19, 22, 63

Генетический вектор – 56, 66, 74-76

Генная (генетическая) инженерия – 5, 7, 26. 63, 89

Генная дактилоскопия -

Генно-модифицированный организм (ГМО) – 98-102

Генодиагностика – 51

Геном – 4, 7, 34, 63, 73

Генотерапия – 51, 56, 57

Гибридизация – 42, 44, 105

Гибридома – 106, 108, 125

Гистон(ы) – 15, 16

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) – 125, 126

Иммуноферментный анализ (ИФА) – 101-103

Инженерная энзимология – 6

Интрон -19, 20, 22

Клеточная инженерия – 5, 105, 10

Клонирование – 106, 115-118

- репродуктивное – 117-119

- терапевтическое – 117, 119

Космиды – 71, 72

Ксенотрансплантация – 112, 113

Культура клеток – 5, 126

Лигаза(ы) -32, 78

Молекулярная биотехнология– 4, 33, 58

Моноклональные антитела – 86, 89, 106

Мононуклеотиды – 13, 27, 34

Нокаут гена – 46, 49, 51

Нуклеаза(ы) – 33

Нуклеиновая кислота – 11, 34, 42

Нуклеосома – 17

Обратная транскриптаза – 31, 34, 36

Олигонуклеотид(ы) – 64

Плазмиды – 67,68, 91, 92

Плюрипотентность – 120-123

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – 39, 52

Полимеразы 29, 30, 82

Праймер – 31, 36, 39, 41

Провирус – 74

Пронуклеус – 107-110

Ревертаза – 31, 34

Рекомбинантная ДНК – 5, 7, 63, 69, 71, 78, 82

Репарация – 46, 58, 59, 62

Репликон – 68, 72, 78

Рестриктазы – 26, 36, 38, 45, 66, 78

Рестрикционный анализ -

Ретровирусы – 73, 108

РНК-интерференция – 47, 49

Сайт рестрикции -26, 27, 29

Сателлитная ДНК – 21, 46

Сверхъемкие векторы – 75-78



  • YAC – векторы – 75, 76

  • ВАС – векторы 75, 76

  • PAC –векторы – 76, 77

  • MAC-векторы - 77

Секвенирование – 34, 35, 37

Стволовые клетки – 122-124

Техническая микробиология – 6

Тотипотентность – 90, 122

Трансген – 110

Трансгенез – 107, 114

Трансгенный продукт – 98

- животное – 112, 115

Транскрипция -22, 32

Трансляция -22, 25

Трансплантация – 112, 120

Трансформация – 82, 91

Фазмиды – 71, 72

Фермент(ы) – 26, 32, 37

Хоуминг – 122

Хромасома(ы) – 17, 18, 59, 75

Хроматин – 15

Экзон -19, 20, 22

Электропорация -82, 95, 109

Электрофорез – 38, 45

Эндонуклеаза – 33, 81

Энхансер – 19, 23



Содержание

Введение ………………..………………………………..…. 3

ГЛАВА 1 .………………………………..….………………. 7

1. Генетическая инженерия. Общие сведения ….... 7

2. ДНК – носитель генетической информации …... 11

Основные отличия между ДНК и РНК (11); структурная организация нуклеиновых кислот (13); структура гена, особенности генома эукариот (18); реализация генетической информации в клетке (22).

3. Ферменты генной инженерии ……………...……. 26

Рестриктазы (27); ДНК-полимеразы (30); обратная транскриптаза или ревертаза (31); ДНК-лигазы (32); нуклеазы (33).

4. Методы изучения генома ………………………… 35

Секвенирование нуклеиновых кислот (35);рестрикционный анализ (38); полимеразная цепная реакция (40); методы гибридизации (42); генная дактилоскопия (45);нокаутирование генов (47);

5. Методы генодиагностики и генотерапии ……… 52

Генодиагностика (52); генная терапия (56); репарация ДНК (59).

6. Алгоритм создания генноинженерного

продукта ………………………………………………….… 63

Получение генов (64); генетический вектор (66); конструирование рекомбинантных ДНК (78); введение рекомбинантных молекул в клетки (82).

7. Генноинженерные продукты ……………………. 84

8. Генетическая инженерия растений …..………… 89

Трансформация растений с помощьюагробактерий (92).

9. Генетически модифицированные продукты.

Методы контроля ГМО ………...…….………...… 99

ГЛАВА 2 ……..………………………………………...…… 106

1. Клеточная инженерия. Общие сведения ………. 106

2. Трансгенез …………………………………………. 108

Внедрение вектора в модифицируемый организм (109); основные направления использования трансгенных животных (113).

3. Клонирование – способ создания новых

организмов ………………………………………………… 117

Способы и методы клонирования (118); репродуктивное и терапевтическое клонирование (120).

4. Перепрограммирование соматических клеток... 123

5. Моноклональные антитела ……………………… 127

Контрольные вопросы .…………………..………….…… 131

Рекомендуемая литература ……………………………… 133

Предметный указатель …………………………………… 134



Поделитесь с Вашими друзьями:
1   2   3   4   5   6   7


База данных защищена авторским правом ©grazit.ru 2017
обратиться к администрации

    Главная страница