Умьянова сауле жумагельдиевна



страница3/4
Дата31.07.2017
Размер0,64 Mb.
1   2   3   4

Полимеразная цепная реакция проводилась согласна ГОСТ Р 52173-2003. Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных организмов растительного происхождения.

Ход анализа состоит из нескольких этапов:



  1. подготовка реакционных смесей в 5 пробирках с добавлением раствора ДНК, выделенные из анализируемого вида крупы и одну пробирку в качестве холостого опыта;

  2. пробирки помещаем со образцами в амплификатор для проведения ПЦР, задавая соответствующие температурные режимы для каждого праймера;

  3. по окончании ПЦР из каждой микроцентрифужной пробирки осторожно из-под слоя вазелинового масла отбирают по 8 мм3 смеси и переносят в отдельный карман геля;

  4. в отдельный карман геля вносят 8 мм3 маркера молекулярной массы ДНК. Гель помещают в камеру прибора для проведения горизонтального электрофореза, заполненную буфером 1 ТБЕ. Электрофорез проводят при напряженности электрического поля 6 В/см геля в условиях стабилизации напряжения в течение 65 мин;

  5. Визуализацию продуктов ПЦР после электрофореза осуществляют с помощью видеосистемы.

Результат идентификации в виде файл-паспорта сохраняется на жёстком магнитном носителе и может быть выведен на видеомонитор или принтер.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программы Statistical Package for Social Sciences (США).

Обнаружение в анализируемой пробе крупяных изделий ПЦР-продукта размером 195 пар нуклеотидов и 180 пар нуклеотидов, или одного из них, свидетельствует о наличии ГМО в анализируемом продукте.

В случае обнаружения в одной из параллельно анализируемых проб крупяных изделий и отсутствия в другой из параллельно анализируемых проб ПЦР-продуктов необходимо повторить весь анализ с еще одной навеской анализируемого продукта.

Отсутствие в анализируемой пробе крупяных изделий ПЦР-продукта 195 пар нуклеотидов и 180 пар нуклеотидов свидетельствует об отсутствии генетически модифицированных организмов в анализируемом продукте.

Для контроля результатов идентификации используют положительный контроль - раствор ДНК, выделенный из стандартного образца состава ГМО и два отрицательных контроля - холостой опыт и раствор ДНК, выделенный из стандартного образца состава генетически не модифицированного организма. Результаты ПЦР для контролей крупяных изделий отечественных производителей перечислены в таблице 3 и результаты ПЦР ввозимых крупяных изделий в таблице 4.

Таблица 3 - Результаты ПЦР крупяных изделий отечественных производителей

Образцы проб



Анализируемая проба

Положительный контроль экстракции

Пустой контроль экстракции

Отрицательный контроль целевой ДНК

Положительный контроль целевой ДНК

Интерпретация результата

Рисовая крупа

(Марки "Акмаржан")


-

+

-

-

+

отрицательный


Кукурузная крупа

(Марки "Цесна")


+

+

+

-

+


Недостаточно для принятия решения

Гречневая крупа

(Марки "Көктем")


-

+

-

-

+

отрицательный


продолжение таблицы 3

Пшеничная крупа

(Марки "Артек")


-

+

-

-

+


отрицательный

Таблица 4 - Результаты ПЦР ввозимых крупяных изделий

Образцы проб



Анализируемая проба

Положительный контроль экстракции

Пустой контроль экстракции

Отрицательный контроль целевой ДНК

Положительный контроль целевой ДНК

Интерпретация результата

Рисовая крупа

(Марки "Taj Mahal", Пакистан)


-

+

-

-

+


Отрицательный

Рисовая крупа

(Марки " Sushi rice ", Китай)


+

+

-

-

+


Положительный

Кукурузная крупа

(Марки "Метака", Белоруссия)


-

-

+

-

-


Недостаточно для принятия решения

Кукурузная крупа

(Марки "Дикая кукуруза", США)


+

+

-

-

+


Положительный

Гречневая крупа

(Марки "Сто пудов", Украина)


-

+

-

-

+


Отрицательный

Гречневая крупа

(Марки "Tropicana", Канада)


-

+

-

-

+


Отрицательный

Пшеничная крупа

(Марки " Хуторок ", Украина)


-

+

-

-

+


Отрицательный

Пшеничная крупа

(Марки "Гудвилл", Россия)


-

-

-

-

-


Недостаточно для принятия решения

Все большое число лабораторий, контролирующих пищевую продукцию, останавливается на методе ПЦР для обнаружении генетически модифицированных организмов. Этот метод позволяет в миллионы раз увеличить количество копий последовательности-мишени с высокой чувствительностью и специфичностью, нарабатывая ее до легко выявляемых количество. При этом два праймера ограничивают последовательность-мишень.

Сравнивая методы ПЦР и ПЦР-РВ при проведении качественного определения генетически модифицированных организмов в крупах имеются значительные различия в методике исследования (таблица 5).

Главные преимущества ПЦР - это очень высокая чувствительность, позволяющая обнаружение крайне малых концентраций в образцах, а также регулируемая специфичность, позволяющая обнаруживать и идентифицировать ГМО. Основной недостаток ПЦР вытекает из его крайне высокой чувствительности - образцы очень легко загрязняют ДНК из положительного контроля, другого образца или продукта ПЦР, что приведет к ложноположительной реакции.

Особенностью ПЦР-РВ обнаружение и определение содержания ДНК с измененной последовательностью, также существенное снижение риска контаминации, сокращение времени анализа, упрощение организации ПЦР лаборатории и автоматическая регистрация, интерпретация полученных результатов. Недостатком данного метода являются сложный дизайн зондов и праймеров, а также высокая стоимость, так как на каждый фрагмент требуется свой специфичный зонд.

Таблица 5 - Сравнение методов ПЦР и ПЦР-РВ



Параметры

ПЦР

ПЦР-РВ

Качественный анализ

+

+

Детекция продуктов амплификации

После окончания реакции:

электрофорез



После каждого цикла. Стадия детекции совмещена со стадией амплификации

Регистрация и интерпретация результатов

Субъективная оценка результатов

Автоматическая

Организация ПЦР лаборатории

Строгое разделение на зоны.

Очень высокий риск контаминации



Зона детекции совмещена с зоной амплификации

Решаемые задачи:

- диагностика


+ только качественный анализ


+качественный +количественный анализ



Время проведения анализа

5-6 часов

20-60 минут

3.3 Качественное определение наличия генетически модифицированных организмов в ввозимых крупяных изделиях


При положительном результате ПЦР для определения трансгенных компонентов качественный анализ является завершающей. Выявление промотора 35S и терминатора NOS с помощью ПЦР представляет собой так называемый "метод скрининга", то есть качественный анализ.

В качестве сравнительной характеристики методов обнаружения трансгенных компонентов в крупяных изделиях были выбраны два наиболее современных методов ПЦР и ПЦР в реальном времени.

По результатам исследования в анализируемых пробах рисовой крупы марки "Sushi rice", поставщиком являющаяся страна Китай и кукурузной крупе марки "Дикая кукуруза" - США, установлены ПЦР-продукты размером 195 пар нуклеотидов и 180 пар нуклеотидов, что свидетельствует о наличии ГМО в анализируемых крупах.

В остальных анализируемых пробах крупяных изделий трансгенные компоненты промотор NOS и терминатор 35S не обнаружены. Отсутствие в анализируемой пробе крупяных изделий ПЦР-продукта 195 пар нуклеотидов и 180 пар нуклеотидов свидетельствует об отсутствии генетически модифицированных организмов в анализируемом продукте.

Обобщенные результаты исследования крупяных изделий, контрольных и исследуемых образцов, на наличие ГМО представлены в таблице 6.
Таблица 6 - Результаты исследования крупяных изделий на определение ГМО с помощью методов ПЦР и ПЦР-РВ

Прямая соединительная линия 6

образцы


варианты

1 повторность

2 повторность

Праймеры

(трансгенные компоненты)



Праймеры

(трансгенные компоненты)



Промотор 35S

терминатор NOS

Промотор 35S

терминатор NOS

Крупы отечественного производства (контрольный обр.)

РИСОВАЯ КРУПА

(Марки "Акмаржан")


-

-b

-

-


КУКУРУЗНАЯ КРУПА

(Марки "Цесна")


-

-

-

-


ГРЕЧНЕВАЯ КРУПА

(Марки "Көктем")


-

-

-

-


ПШЕНИЧНАЯ КРУПА

(Марки "Артек")



-

-

-

-


Крупы, ввозимые из зарубежных стран (исследуемый обр.)

РИСОВАЯ КРУПА

(Марки "Таj Mahal", Пакистан)


-

-

-

-


РИСОВАЯ КРУПА

(Марки "Sushi rice", Китай)


+а


+

+

+


КУКУРУЗНАЯ КРУПА

(Марки "Метака", Белоруссия)


-

-

-

-


КУКУРУЗНАЯ КРУПА

(Марки "Дикая кукуруза", США)


+

+

+

+


продолжение таблицы 6




ГРЕЧНЕВАЯ КРУПА

(Марки "Сто пудов", Украина)


-

-

-

-


ГРЕЧНЕВАЯ КРУПА

(Марки "Tropicana", Канада)



-

-

-

-


ПШЕНИЧНАЯ КРУПА

(Марки " Хуторок ", Украина)


-

-

-

-


ПШЕНИЧНАЯ КРУПА

(Марки "Гудвилл", Россия)


-

-

-

-



а Продукт ПЦР обнаружен (+)

b Продукт ПЦР не обнаружен (-)

В таблице даны результаты исследования на выявления трансгенных компонентов терминатор NOS и промотор 35S в крупяных изделиях.

Результаты проведенных исследований методами ПЦР и ПРЦ-РВ идентичны в обоих случаях.

При параллельном испытании 12 образцов крупяных изделий, показано, что данные методы являются сопоставимы по специфичности (во всех анализируемых положительных пробах были выявлены одни и те же регуляторные гены), но по продолжительности анализа (время ПЦР-РВ колеблется от 20-60 минут, метод ПЦР варьируется от 4 до 5,8 ч) различны.

В качестве исследования безопасности выявленных трансгенных крупяных изделий: генетически модифицированной кукурузы и трансгенного риса были проведены дополнительные исследования на определения содержания тяжелых металлов и микотоксинов, минеральных веществ в ГМ культуре и культуре, выращенного по традиционной технологии, а также проведен сравнительный зерновой анализ.

Содержание тяжелых металлов в ГМ-рисе и рисе, выращенного по традиционным технологиям, не превышало регламенты, принятые в Республике Казахстан (таблица 7) [5,6].

Также не выявлено существенных различий в содержании минеральных веществ в рисе обоих видов (таблица 8) [4].
Таблица 7 - Санитарно-химические показатели безопасности риса

Показатель

Рис, выращенный по традиционной технологии

ГМ-рис


Мышьяк, мг/кг

<0,1

<0,1

Свинец, мг/кг

0,051

0,023

Кадмий, мг/кг

0,036

0,008

Дезоксиниваленол, мкг/кг

Не обнаружено

Не обнаружено

Зеараленон, мкг/кг

Не обнаружено

Не обнаружено

Афлотоксин В1, мкг/кг

Не обнаружено

Не обнаружено

Токсин Т 2

Не обнаружено

Не обнаружено

Таблица 8 - Сравнительное содержание минеральных веществ (мг/кг) в рисе



Показатель

Рис, выращенный по традиционной технологии

ГМ-рис


Мышьяк, мг/кг

<0,1

<0,1

Свинец, мг/кг

0,051

0,023

Кадмий, мг/кг

0,036

0,008

Дезоксиниваленол, мкг/кг

Не обнаружено

Не обнаружено

Зеараленон, мкг/кг

Не обнаружено

Не обнаружено

Афлотоксин В1, мкг/кг

Не обнаружено

Не обнаружено

Токсин Т 2

Не обнаружено

Не обнаружено


Поделитесь с Вашими друзьями:
1   2   3   4


База данных защищена авторским правом ©grazit.ru 2017
обратиться к администрации

    Главная страница