1. Представьте строение и свойства молекулы ДНК



страница1/4
Дата07.06.2018
Размер1.92 Mb.
  1   2   3   4

ГИ экзамен.

1. Представьте строение и свойства молекулы ДНК.

2. Объясните какие ферменты используются в генетической инженерии.

3. Обоснуйте использование рестриктаз.

4. Обоснуйте использвоание ДНК-лигаз в генетической инженерии.

5. Обоснуйте использование ДНК-полимеразы E.coli в генетической инженерии.

6. Обоснуйте использование обратной транскриптазы.

7. Объясните какие методы конструирования ДНК in vitro.

8. Объясните как работает рестриктазно-лигазный метод.

9. Представьте модель векторных молекул ДНК.

10. Представьте методы введения молекул ДНК в клетки.

11. Обоснуйте методы отбора гибридных клонов.

12. Объясните метод фенотипической селекции.

13. Представьте метод гибридизации нуклеиновых кислот in situ.

14. Объясните, что такое расшифровка нуклеотидной последовательности ДНК.

15. Опишите плюс-минус метод.

16. Опишите метод Сэнгера.

17. Объясните автоматическое секвенирование ДНК.

18. Объясните, что представляют собой базы данных нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.

19. Представьте известные геномные проекты.

20. Объясните метод амплификации последовательностей in vitro.

21. Объясните, что такое полимеразная цепная реакция.

22. Приведите примеры использования ПЦР.

23. Объясните использование ПЦР для клонирования заданных фрагментов ДНК.

24. Опишите применение олигонуклеотидных микрочипов.

25. Опишите блотинг по Саузерну.

26. Объясните иммуноблотинг.

27. Как проводят введение плазмидных и фаговых молекул ДНК в клетки E.coli.

28. Опишите метод электропорации.

29. Опишите молекулярные векторы E.coli.

30. Объясните конструирование плазмид pBR325.

31. Опишите космиды.

32. Объясните генетическую инженерию культивируемых клеток млекопитающих.

33. Объясните, как происходит введение ДНК в клетки млекопитающих.

34. Опишите метод микроинъекции вирусных молекул ДНК.

35. Представьте генетическую трансформацию клеток млекопитающих.

36. Опишите котрансформацию.

37. Опишите регулируемую экспрессию целевых генов.

38. Опишите трансгенные животные.

39. Опишите получение трансгенных животных.

40. Опишите эмбриональные стволовые клетки.

41. Представьте экспрессию генов в трансгенных мышах.

42. Обоснуйте использование трансгенных животных в фундаментальных исследованиях.

43. Опишите нокаутные мыши.

44. Обоснуйте биотехнологическое применение трансгенных животных.

45. Объясните понятие трансгенные растения.

46. Объясните, как происходит перенос генов в растения из бактерий рода Agrobacterium.

47. Обоснуйте использование Ti-плазмиды в создании трансгенных растений.

48. Опишите получение трансгенных растений с использованием бинарной системы.

49. Опишите, как происходит экспрессия и наследование чужеродных генов, введенных в растения в составе тДНК.

50. Опишите прямой метод введения трансгена в растения.

51. Опишите, как происходит синтез в растениях чужеродных белков медицинского назначения.

52. Объясните, что такое съедобные вакцины.

53. Объясните, как осуществляется перенос генов в растения с помощью вирусов.

54. Опишите вирус мозаики коровьего гороха.

55. Объясните трансгенную систему хлоропластов.

56. Представьте белковый сплайсинг в трансгенных растениях.

57. Обоснуйте переспективы использования трансгенных растений с новыми биотехнологическими свойствами.

58. Обоснуйте использование трансгенных растений в сельском хозяйстве.

59. Опишите геномодифицированные продукты.



60. Опишите методы анализа ГМО.

1. Представьте строение и свойства молекулы ДНК.

Главным объектом генно-инженерного воздействия яв-ся дезоксиробонуклеиновая кислота. ДНК является полимером нуклеотидов. Нуклеотид состоит из 3 компонентов: пуринового или пиримидинового основания, пятиуглеродного циклического сахара. В ДНК имеются нуклеотиды четырех типов, различающиеся лишь азотистыми основаниями. К ним относятся два пурина(Pu) – аденин(A) и гуанин(G)- и два пиримидина(Py)- тимин(T) и цитозин(C). Особенностью ДНК является то, что ее молекула обычно сост. из двух полимерных цепей, закрученных в двойную спираль. Каждая цепь - это регуляторный полимер, в кот-м остатки сахара двух соседних нуклеотидов связаны при помощи фосфатных групп. В образов. этой связи всегда принимают участие 5'-фосфат одного нуклеотида и 3'-гидроксил остатка сахара др. Поэтому углеводно-фосфатный остов молекулы имеет регулярную структуру. Пуриновые и пиримидиновые основания обращены внутрь двойной спирали и расположены параллельно друг другу и перпендикулярно оси спирали. Две цепи удерживаются вместе при помощи водородных связей между парами оснований. Аденин всегда спаривается с тимином, а гуанин - с цитозином. Строгая специфичность спаривания обусловливает комплементарность, т. е. взаимное соответствие последовательностей оснований в двух цепях. При этом полинуклеотидные цепи в двойной спирали ДНК отличаются одна от другой как последовательностью оснований, так и нуклеотидным составом. По своему химическому строению две цепи молекулы ДНК ориентированы противоположно (антипараллельны). Это легко увидеть, если пометить в цепях направление от 5'-конца к З'-концу (5'-3') . Важным свойством ДНК яв-ся то, что 3' ,5' -фосфодиэфирная связь углеводно-фосфатного остова молекулы наиболее чувствительна как к хим-му, так и к ферментативному расщеплению. Для функ-ния ДНК в процессах репликации и транскрипции большое значение имеет возможность легкого расхождения цепей при определенном воздействии и их последующего воссоединения. Когда водородные связи между основаниями разрываются, цепи, образующие двухцепочечную молекулу ДНК, расходятся. Денатурацию ДНК (плавление вторичной структуры) можно осущ. в р-ре, увел. его тем-ру либо изменяя рН. Стабильность двухцепочечного комплекса прямо зависит от того, сколько он содержит GC-nap, связанных тремя водородными связями. Денатурация обратима даже после полного разделения двух цепей. Если инкубировать комплементарные цепи при тем-ре примерно на 25 °С ниже тем-ры плавления исходного дуплекса, то они начинают реассоциировать и при опред. условиях образ. исходную спираль. Этот процесс называется ренатурацией или отжигом. Ренатурация ДНК осуществляется в два этапа. Сначала в результате случайных столкновений одноцепочечных молекул происходит правильное соед. коротких комплементарных отрезков. После образования таких двухцепочечных структур идет быстрое ≪схлопывание≫ по всей длине и восстановление исходной двуспиральной молекулы ДНК. Транскрипция, т. е. считывание с молекулы ДНК матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК), соответствующей определенному гену, осущ. ферментом РНК-полимеразой. При этом первоначально РНК-полимераза взаимодействует с определенным районом ДНК, предшествующим кодирующей последовательности гена, — промотором. Двухцепочечные гибриды ДНК-РНК, образующиеся в процессе транскрипции, существуют лишь очень непродолжительное время. Новосинтезированные цепи РНК быстро отделяются от транскрипционного комплекса, после чего транскрибированные участки ДНК возвращаются в нативное состояние. Трансляция с мРНК белковой молекулы происходит последовательно, начиная с 5'-конца матрицы. Первую аминокислоту белковой цепи называют N-концом (или амино-концом), а последнюю — С-концом (или карбокси-концом).

2, 3, 4, 5, 6. Ферменты генетической инженерии.

Ферменты генетической инженерии – это ферменты, позволяющие проводить различные манипуляции с молекулами ДНК: разрезать в определенных местах, соединять различные по происхождению фрагменты, синтезировать новые, не существующие в природе последовательности, и т.д.



ДНК-полимеразы. Одним из наиболее часто используемых в генетической инженерии ферментов является ДНК-полимераза Ī, выделенная из E.coli или фага Т4. ДНК-полимераза Ī обладает способностью удлинять цепь ДНК в направлении 5́→ 3 ́ путем присоединения комплементарного нуклеотида. Это свойство ДНК-полимераз используется в генной инженерии для построения второй комплементарной цепи: при добавлении фермента к одноцепочной ДНК-матрице в присутствии праймера произойдет ее удвоение. Это свойство используется, например, при создании Кднк-библиотек. ДНК-полимераза применяется также для заполнения «бреши» в цепи ДНК, например, при застраивании фрагментов с выступающими 5 ́- концами. экзонуклеазная активность ДНК-полимераз используется для введения радиоактивной метки во фрагмент ДНК.

Использование специфических термостабильных ДНК-полимераз – Tth- и Taq- полимераз – выделенных из бактерий, живущих в гейзерах, позволило проводить амплификацию – множественную наработку любого фрагмента ДНК методомполимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР, в основу которого положена Taq-полимераза, не только упростил некоторые старые методики генной инженерии, но и позволил проводить молекулярное маркирование как отдельных генов, так и целых геномов.

Из некоторых вирусов была выделена специфическая ДНК-полимераза – РНК-зависимая ДНК-полимераза, названная обратной транскриптазой, или ревертазой. Ревертазы могут синтезировать комплементарную цепь ДНК на РНК-матрице. С помощью ревертаз можно получать кДНК-ДНК-копии мРНК. кДНК позволяют изучать строение генов и идентифицировать полноценные копии этих генов в геноме.

ДНК-лигаза осуществляет одну функцию – соединение фрагментов ДНК путем восстановления фосфодиэфирных связей между соединениями нуклеотидами. Этот процесс называется лигированием. Наиболее часто для лигирования в генной инженерии используют ДНК-лигазу фага Т4. с помощью лигазы Т4 соединяют любые фрагменты ДНК с любыми концами: «липкими» или «тупыми». Это один из наиболее часто использующихся ферментов.

Нуклеазы – это большая группа ферментов, катализирующих реакцию гидролиза молекул нуклеиновых кислот. В результате действия нуклеаз молекула ДНК или РНК распадается на фрагменты или отдельные нуклеотиды. Исходная функция нуклеаз в клетке – деградация ненужных в данный момент жизнедеятельности молекул (например, деградация мРНК после трансляции) и защита от чужеродных молекул нуклеиновых кислот (расщепление фаговой ДНК бактериальными нуклеазами при заражении бактерии фагом).

Кроме того, нуклеазы можно разделить на два типа: на экзонуклеазы и эндонуклеазы. Экзонуклеазы обычно гидролизуют молекулы с 5 ́- или 3 ́- свободных концов, а эндонуклеазы могут расщеплять внутри последовательности фрагмента или кольцевой молекулы ДНК.



Рестриктазы. Отдельную группу, особенно с утилитарной точки зрения ее применения в генной инжененрии, представляют специфические эндонуклеазы – рестриктазы.

В основе метода, позволившего непосредственно приступить к манипуляциям с генами, лежит открытие ферментов, названных рестрикционными эндонуклеазами (рестриктазами). Еще в 1953г. было обнаружено, что ДНК определенного штамма E. Coli, введенная в клетки другого штамма (например, ДНК штамма В в клетки штамма С), не проявляет, как правило, генетической активности, так как быстро расщепляется на фрагменты ДНК-специфическими ферментами – рестриктазами. К настоящему времени из разных микроорганизмов выделено более тысячи различных рестриктаз. В генетической инженерии наиболее широко используются коло 200.

Рестриктазы предщставляют собой особый класс эндонуклеаз, которые гидролизуют ДНК строго по определенным специфическим последовательностям, называются сайтами рестрикции.каждая из рестриктаз узнает свой свой сайт рестрикции и разрезает ДНК либо внутри последовательности сайта рестрикции, либо в непосредственной близости от него. Таким образом, при действии конкретной рестриктазы одна и та же последовательность ДНК будет всегда образовывать одинаковый набор фрагментов. Обозначение рестриктаз складывается из начальных букв латинского названия вида бактерий, из которого был выделен фермент, и дополнительного обозначения, так как из бактерий одного вида может быть выделено несколько различных рестриктаз: Eschrichia coli – EcoR I. EcoRV. Haemophilus influenzae – Hinf I. Streptomices albus – Sal I. Thermus aquaticus – Taq I.

Рестриктазы делятся на несколько типов по характеру расщепления нуклеотидной последовательности. Рестриктазы Ī типа узнают сайт рестрикции, но расщепляют последовательность ДНК на произвольном расстоянии (от нскольких десятков до нескольких тысяч пар нуклеотидов) от сайта узнавания. Такие рестриктазы невозможно использовать для решения генно-инженерных задач. Рестриктазы ĪĪĪ типа похожи на рестриктазы Ī типа, они гидролизуют ДНК на на рвсстоянии 20 – 35 н.п. от сайтов узнавания и также довольно редко используются в практических целях.

Ферменты, используемые для получения рекомбинантных молекул, - рестриктазы ĪĪ типа. Основной характеристикой таких рестриктаз является то, что у них сайты узнавания и места рестрикции совпадают. Обычно рестриктаза ĪĪ типа узнает определенную последовательность на ДНК и гидролизует ее внутри последовательности сайта рестрикции. Сайты рестрикции рестриктаз ĪĪ типа представлены симметричными при повороте на 180 градусов последовательностями – палиндромами.

Рестриктазы ĪĪ типа можно отнести к двум группам по тому , как они расщепляют последовательность ДНК. Одни вносят разрывы по оси симметрии узнаваемой последовательности, а другие – со сдвигом, с образованием «ступеньки». В первом случае образуются так называемые «тупые» концы, а во втором – «липкие»,т.е. фрагменты имеют на своих концах однонитевые взаимно комплементарные участки.

Фрагменты ДНК,имеющие одинаковые «липкие» концы, могут соединяться друг с другом с помощью ДНК-лигазы, при этом сайт рестрикции восстанавливается. Фрагменты с «липкими» концами более удобны для создания рекомбинантных ДНК, так как ДНК-лигаза обеспечивает беспрепятственное соединение фрагментов.

7. Методы конструирования ДНК in vitro.

Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные объединением in vitro двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников.

Фрагменты ДНК, в том числе и фрагменты, содержащие гены, получают с использованием ферментов рестриктаз. Рестриктазы могут образовывать фрагменты как с тупыми, так и с липкими концами. Сшивка фрагментов ДНК производится тремя основными методами, зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК.

8. Сшивка по одноименным "липким" концам (рестриктазно лигазный метод)

Этот метод является самым распространенным и популярным. Некоторые рестриктазы, например Pst I, внося в цепи ДНК симметричные, расположенные наискось друг от друга разрывы на равных расстояниях от центра сайта узнавания и образующие "ступеньку”. Эти комплементарные друг другу участки имеют тенденцию к ассоциации за счет спаривания оснований, и поэтому их называют комплементарными или липкими концами. Спаривание оснований происходит только между комплементарными последовательностями. Но любые два фрагмента (независимо от их происхождения), образовавшиеся под действием одной и той же рестриктазы, могут слипаться за счет образования водородных связей между однонитевыми участками комплементарных нуклеотидов (рис. 39).



Рис. 39. Схема рестриктазно - лигазного метода

Однако после такого спаривания полной целостности двойной спирали не восстановится, поскольку останется два разрыва в фосфодиэфирном остове. Для его восстановления, то есть сшивания, или лигирования нитей используют фермент ДНК-лигазу. Этот фермент в живой клетке выполняет ту же функцию - сшивание фрагментов ДНК, синтезирующихся при репликации.

Сшивка по "тупым" концам (коннекторный метод)

Липкие концы не абсолютно необходимы для связывания фрагментов ДНК. Тупые концы также могут быть соединены за счет действия ДНК-лигазы, если и лигаза, и тупые концы присутствуют в реакционной смеси в высоких концентрациях. В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и ее эффективность ниже, чем при сшивке по липким концам. Для этого используют фермент - концевую трансферазу из тимуса теленка, которая присоединяет нуклеотиды к 3 -концам цепей ДНК. Если к 3'-концам одного из рекомбинируемых in vitro фрагментов ДНК с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы достроить одноцепочечные олиго (dA)-сегменты определенной длины, а к концам другого фрагмента — олиго (dT)-сегменты примерно такой же длины, то при смешении полученных таким образом фрагментов происходит спаривание за счет образования водородных связей между олиго (dА)- и олигo (dT) -последовательностями (рис. 40). Для ковалентного соединения двух фрагментов используется ДНК-лигаза. Эти процедуры составляют основу для второго общего метода получения рекомбинантных молекул ДНК.





Рис. 40. Пришивание «липких» концов и сшивка фрагментов ДНК

Поскольку можно формировать достаточно длинные взаимокомплементарные одноцепочечные концы, гибридные молекулы образуются с высокой эффективностью. В частности, поэтому при клонировании ДНК-копий матричных РНК, которые доступны в ограниченных количествах, обычно используют коннекторный метод. При таком способе соединения между фрагментами встраиваются участки ААААА. Такие дополнительные последовательности ТТТТТ могут влиять на функции соединяемых молекул и поэтому всегда, когда только возможно, для получения рекомбинантных молекул ДНК пользуются липкими концами, образовавшимися в результате действия рестриктаз.



Каталог: uploads
uploads -> Представление
uploads -> Городу иркутску 355 лет Иркутский хронограф
uploads -> Лекция «Здравоохранение Амурской области»
uploads -> Закон о промышленной безопасности опасных
uploads -> Литература О. Николенко п. 1 читать, п. 2-4 конспект; читать Педро Кальдерон "Життя-це сон"
uploads -> Дрижд николай александрович
uploads -> Становление советского флота
uploads -> Грузовое судно, которое частично использует солнечную энергию, было построено японскими судостроителями на верфи «Imabari Shipbuilding Industry Ltd»


Поделитесь с Вашими друзьями:
  1   2   3   4


База данных защищена авторским правом ©grazit.ru 2019
обратиться к администрации

войти | регистрация
    Главная страница


загрузить материал