1. Представьте строение и свойства молекулы ДНК


Сшивка фрагментов с разноименными липкими концами



страница2/4
Дата07.06.2018
Размер1.92 Mb.
1   2   3   4

Сшивка фрагментов с разноименными липкими концами

В ситуации, когда необходимо сшить фрагменты, образованные разными эндонуклеазами рестрикции, и имеющие разные, то есть некомплементарные друг другу липкие концы, применяют так называемые линкеры (или "переходники"). Линкеры - это химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию. Существуют большие наборы таких генных "переходников". Часто в середину линкера помещают какой-либо регуляторный генетический элемент, например, промотор или участок, связанный с рибосомой. В этом случае линкеры обеспечивают не только объединение генов, но и обуславливают их экспрессию. Существуют линкеры "тупой конец - липкий конец".



При необходимости липкие концы можно превратить в тупые. Это достигается либо отщеплением липких концов с помощью фермента - эндонуклеазы S1, которая разрушает только одноцепочечную ДНК, либо липкие концы "застраивают", то есть с помощью ДНК-полимеразы I на однонитевых липких концах синтезируют вторую нить.

9. Представьте модель векторных молекул ДНК.

Вектор — мол.ДНК, исп-емая в ГИ для передачи ген-го материала другой кл. Вектор должен обл.след.св-вами: 1. Способность к автономной репликаций. 2. Наличие сайта, в к-м возможно встраивание желаемого фрагмента ДНК. 3. Наличие одного или нескольких маркерных генов, благодаря к-м кл.-реципиент будет обладать новыми признаками, позволяющими отл.трансформированные кл. Это м.б. селективные гены, которые придают кл-м селективное преимущество (устойчивость к антибиотикам).

Плазмиды – внехромосомные ген-ские элем-ы прокариот, к-е автономно реплицируются в клетке. Плазмида, исп-емая в кач.вектора, должна иметь 3 характеристики: иметь сайт ori(участок инициаций репликаций) для нормальной репликаций ДНК и размножения плазмиды в клетке, доминантный селективный маркер, к-й позволяет отобрать кл., несущую плазмиду с встроенным фрагментом чужеродной ДНК, иметь сайт рестрикции. Плазмидный вектор рBR322 создан на основе плазмиды E.coli. Плазмида рBR322 имеет сайт ori (область, ответственную за репликацию плазмиды), гены устойчивости к антибиотикам ампициллину (Ap′) и тетрациклину (Tc′). В гене TC′ имеется уникальный сайт, разрезаемый рестриктазой Bam HI. В плазмидах можно клонировать фрагменты ДНК размером не более 10 тпн.

Фаговые векторы. Чаще всего создают на базе бактериофага λ, сод-го 2цепочечную линейную мол.ДНК. Левое и правое плечи фага имеют все гены, необх-е для репликации. Исп-т для клон-ия фрагментов ДНК эук. (т.е. более крупных генов) размером до 23 тпн.

Космида – это векторная плазмида, предназначенная для клонирования больших фрагментов ДНК эукариот (до 45тпн) в клетках E. coli. Термин обозначает, что вектор является плазмидой, внутри которой вставлен cos-участок фага λ , представляющий собой н/дную посл-ть, к-я отвечает за упаковку фаговой ДНК в ее протеиновую капсулу . Космиды созданы искусственно в результате комбинаций плазмид и фага λ. Космида имеет посл-ть ori, позволяющая репликацию в кл, селективный маркер ампициллин и уникальные сайты рестрикций . Челночные векторы. Способны реплицироваться в двух и более организмах-хозяевах. Yep24 имеет посл-ть ori,позволяющую реплецироваться в E.Coli и селекционный маркеры ampR и tetR (E.Coli), а также URA3(контроль биосинтеза урацила для клеток дрожжей), посл-сть специфичную для дрожжей-2m circle, позволяющую реплицироваться автономно в дрожжевой клетке. Искусственные хромосомы дрожжей. Хар-ки: теломеры на каждом конце, центромерные посл-ти(CEN), селекционные маркеры на каждом плече, автономно реплецирующая посл-ть ARS,позволяющие реплицироваться в дрож.кл., рестикционные сайты.Фазмиды также являются гибридами между фагом и плазмидой. После встройки чужеродной ДНК могут в одних условиях развиваться как фаги, в других – как плазмиды. Транспозоны - сегменты ДНК, к-е контр-т собственную транспозицию (перемещение) из одного сайта ДНК в другой путем вырезания из исходного сайта и внедрения в новый сайт хромосомы или плазмиды. ДНК переносится ферментом транспозазой. Длина: 2-10 тыс.н/дных пар. Перенос генов при пом.транспозонов имеет большие преимущества: происходит с высокой частотой и не влечет значительных перестроек интегрируемой ДНК, можно переносить большие фрагменты ДНК.

Вирусы. При вирусной инфекции кажд. кл.может получить большое число копий чужеродного гена. Например, в ДНК SV40 был встроен ген β-глобина кролика, который экспрессировался в линии клеток обезьяны, зараженных рекомбинантным вирусом: в клетках синтезировались и мРНК гена глобина, и сам белок.

10. Представьте методы введения молекул ДНК в клетки.

Известны многочисленные методы, с помощью которых можно внедрить чужеродную ДНК в геном различных организмов. Трансформация экзогенной ДНК может осуществляться либо в культуре клеток (in vitro = ex vivo), либо непосредственно в организме (in vivo) с использованием следующих методов. Микроинъекция. С помощью тонких микроигл и микроманипулятора в клетку или прямо в ядро вводится векторная ДНК с включенным в нее трансгеном. Недостаток: сложность и невысокая производительность. Исп.для введения векторных ДНК и плазмид. Электропорация. Животные клетки обрабатывают импульсами электрического поля высокого напряжения, что обратимо увеличивает проницаемость биомембран. Через образующиеся на короткое время поры чужеродная ДНК проникает в клетку. Липосомный метод. Липосомы – это искусственно созданные сферические образования, оболочка которых состоит из фосфолипидов. Липосомы, сод.трансформирующую ДНК, способны непосредственно сливаться с мемб.кл.или поглощаться кл. В кл.происходит разрушение оболочки липосом и высвобождение рекДНК. Это один из методов, который используется для защиты трансформирующего генетического материала от разрушительного действия нуклеаз, присутствующих вне клеток. Бомбардировка микропулями (баллистическая трансформация). Таким путем проводят генотерапию у животных и человека и введение трансгена в однодольные растения, не восприимчивые к агробактериям. Для «обстрела» тканей используются частицы из золота или вольфрама размером 0,6–3 мкм, на которые наносится ДНК вектора, содержащий трансген. Этими частицами («микропулями») заряжают «генные» пушки. Микропули разгоняются в установке под действием электрического разряда или под давлением газа гелия. При достаточной скорости эти частицы могут непосредственно проникать в ядро, что сильно повышает эффективность трансформации. Исп.ретровирусов. Сост.из двух частей: векторная часть и линия кл.-упаковщика. Векторная часть кодирует структурные белки ретровирусов и именно эти белки замещаются интересующими нас генами. Преим: м.б.получена 100% обработка эмбриональных клеток. Недостатки: м.б.вставлены не более 8 тыс.п.н.-малый размер вставки, подавление экспрессии трансгенов, вероятность активации клеток онкогенов, низкий титр ретровирусных векторов. Гипертонический солевой метод. Если на монослой клеток нанести ДНК вируса полиомы в гипертоническом солевом растворе конц.0,5-1М обр-ся бляшки лизированных клеток. Увел.осмотического давления среды приводило к активному поглощению ДНК. Недостаток: для других в-в инфекционность ДНК была ниже. ДЭАЭ-метод – диэтиламиноэтилдекстрановый. ДЭАЭ значительно увеличивает эффективность трансфекции кл.животных н.к-й вируса SV40. При этом ДНК образует с фосфатом Ca прочный комплекс, к-й при опт.усл-ях поглощается практически всеми клетками. Эффективность поглощения зависит от рН среды и конц.ДНК. Агробактериальный метод - ...



11. Обоснуйте методы отбора гибридных клонов

Смесь молекул, полученных после встройки в выбранный молекулярный вектор фрагментов экзогенной ДНК, вводят в компетентные клетки. Если при этом в вектор статистически встраивают большой набор разных фрагментов донорной ДНК, то вероятность встройки каждого конкретного фрагмента невелика. В этом случае необходимо иметь методы, позволяющие в большом многообразии получаемых гибридных клонов выявлять необходимые. В связи с этим большое значение имеют методы скрининга клонов, содержащих целевые гибридные ДНК.



1. Фенотипическая селекция. Первичный отбор гибридных клонов значительно упрощается, если в векторной молекуле предусмотрена специальная фенотипическая система селекции. При трансформации клеток чаще всего используются векторные молекулы ДНК, несущие гены устойчивости к антибиотикам и антиметаболитам. Поэтому на среде с определенным антибиотиком или антиметаболитом будут расти только клетки трансформантов.

2. Гибридизация нуклеиновых кислот in situ. Основной недостаток методов фенотипического выявления гибридных клонов плазмид и вирусов заключается в том, что с их помощью не удается отобрать гибриды, содержащие специфические последовательности ДНК. Последнее можно выявить методами гибридизации нукл. кислот in situ в колониях трансформированных клеток или в бляшках вирусов. Гибридизация in situ — гибридизация между денатурированной ДНК клеток и меченной радиоактивными изотопами одноцепочечной РНК или ДНК.

3. Функциональная комплементация. Большой интерес для генетической инженерии представляет достижение правильной экспрессии клонированной генетической информации в клетках-реципиентах. Экспрессию легко выявить, если клонируемый ген при правильной транскрипции и трансляции обеспечивает функциональную комплементацию мутаций генома клетки. В этом случае, нужный гибрид может быть обнаружен простым отбором трансформированных клонов на селективной среде.

4. Радиоиммуноанализ белков in situ. Одним из приоритетных направлений генно- инженерных исследований является достижение правильной экспрессии генов высших эукариот и их вирусов в бактериальных клетках. В данных случаях экспрессию многих клонированных генов уже нельзя выявить по функциональной комплементации в силу некоторых различий в организации прокариотических и эукариотических клеток. Поэтому в данной ситуации можно использовать метод радиоиммуноанализа белков in situ. В основу метода положена способность молекул иммуноглобулинов связываться с полистиролом или поливинилом. Кроме того, предполагается, что исследуемый белок имеет не менее двух антигенных детерминант и может связывать по крайней мере две разные молекулы иммуноглобулинов, присутствующих в препарате поликлональных антител, полученных на целевой белок.
.

12. Объясните метод фенотипической селекции

Первичный отбор гибридных клонов значительно упрощается, если в векторной молекуле предусмотрена специальная фенотипическая система селекции. При трансформации клеток чаще всего используют векторные молекулы ДНК, несущие гены устойчивости к антибиотикам и антиметаболитам. Поэтому на среде с определенным антибиотиком или антиметаболитом будут расти только клетки трансформантов. Данная система селекции хорошо отработана для бактерий, т.к. получены векторные плазмиды, детерминирующие устойчивость трансформированных клеток сразу к нескольким антибиотикам. Если векторная плазмида определяет устойчивость к двум антибиотикам и при встройке в нее экзогенного фрагмента ДНК нарушается одна из генетических детерминант устойчивости к антибиотикам, то клоны клеток, содержащих такие гибридные ДНК, легко отличить от трансформантов, включающих исходный вектор, на средах с каждым антибиотиком в отдельности. Н-р, если векторная плазмида детерминирует устойчивость одновременно к тетрациклину и ампициллину и при встройке в нее чужеродного фрагмента нарушается ген устойчивости к ампициллину, то гибридная плазмида будет обуславливать фенотип клетки- хозяина, т.е. устойчивость к тетрациклину и чувствительность к ампициллину. Плазмиды после встройки в них фрагментов ДНК вводят в клетки, культуру высевают на чашки с агаризованной питательной средой, в которую добавлен тетрациклин. При этом вырастают колонии клеток, содержащих или исходную векторную плазмиду, или гибридные плазмиды. Затем колонии перепечатывают на чашки с ампициллином и чашки с тетрациклином. Те колонии, которые после перепечатки будут расти на среде с тетрациклином и не дадут роста на среде с ампициллином, содержат гибридные плазмиды. Простота манипуляций обусловила широкое использование данного типа векторов для клонирования самых разных фрагментов ДНК. Однако такие плазмиды не позволяют осуществлять прямой отбор гибридных клонов – сразу после высева трансформантов на селективную среду и появления колоний. Получен ряд векторных плазмид, предназначенных для прямой селекции трансформантов, содержащих гибридные плазмиды. Такие векторы обычно имеют гены, потенциально летальные для чувствительных клеток- реципиентов, и могут трансформировать эти клетки только после инактивации данных генов встраиванием в них фрагментов ДНК. Внедрение экзогенных фрагментов в состав ДНК вирусов обычно приводит к повреждению определенных вирусных генов, а часто возможно лишь при выщеплении сегмента вирусной ДНК. Поэтому гибридные вирусы являются мутантными. Обычно использую такие варианты клонирования, при которых формируемый мутантный вирус жизнеспособен. Мутантные вирусы удается отличать от исходного векторного, что позволяет достаточно просто выявлять гибридные вирусы.


13. Представьте метод гибридизации нуклеиновых кислот in situ

Основной недостаток методов фенотипического выявления гибридных клонов плазмид



и вирусов заключается в том, что с их помощью не удается отобрать гибриды, содержащие специфические последовательности ДНК. Последние можно легко выявить методами гибридизации нуклеиновых кислот in situ в колониях трансформированных клеток или в бляшках вирусов. Для примера можно рассмотреть схему гибридизации нуклеиновых кислот в колониях Escherichia coli. Колонии бактерий, выросшие после трансформации их плазмидной ДНК, перепечатывают на нитроцеллюлозный фильтр, который помещают в чашку на агаризованную питательную среду и инкубируют до появления на нем колоний клеток. Расположение колоний на фильтре соответствует их расположению на матричных чашках. Клетки в колониях на фильтре лизируют в условиях, вызывающих денатурацию ДНК. Затем на обработанных фильтрах проводят гибридизацию адсорбировавшейся ДНК исследуемых клонов с радиоактивно высокомеченным препаратом целевой ДНК (или РНК) в условиях, благоприятных для образования комплементарных комплексов. Клоны, в которых произошла гибридизация нуклеиновых кислот, обнаруживаются радиоавтографически. Соответствующие бактериальные клоны с матричных чашек переносят в питательную среду и наращивают. Часть выросшей культуры каждого клона помещают на хранение в глицерине при температуре -70 °С, а из остальной части выделяют плазмидную ДНК и подвергают ее необходимому анализу.

Схема метода гибридизации нуклеиновых кислот in situ: 1 – матричная чашка; 2 –нитроцеллюлозный фильтр; 3 – чашка с агаризованной питательной средой; 4 – рентгеновская пленка; J – отобранные клоны



Каталог: uploads
uploads -> Представление
uploads -> Городу иркутску 355 лет Иркутский хронограф
uploads -> Лекция «Здравоохранение Амурской области»
uploads -> Закон о промышленной безопасности опасных
uploads -> Литература О. Николенко п. 1 читать, п. 2-4 конспект; читать Педро Кальдерон "Життя-це сон"
uploads -> Дрижд николай александрович
uploads -> Становление советского флота
uploads -> Грузовое судно, которое частично использует солнечную энергию, было построено японскими судостроителями на верфи «Imabari Shipbuilding Industry Ltd»


Поделитесь с Вашими друзьями:
1   2   3   4


База данных защищена авторским правом ©grazit.ru 2019
обратиться к администрации

войти | регистрация
    Главная страница


загрузить материал