1. Представьте строение и свойства молекулы ДНК


Объясните, что такое расшифровка нуклеотидной последовательности ДНК



страница3/4
Дата07.06.2018
Размер1.92 Mb.
1   2   3   4
14. Объясните, что такое расшифровка нуклеотидной последовательности ДНК

Развитию генетической инженерии в немалой степени способствовала разработка высокоэффективных методов расшифровки нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК. Расшифровку нуклеотидной последовательности нуклеиновых кислот принято называть секвенированием. 1. «Плюс-минус»- метод. Первый метод секвенирования ДНК (Ф. Сэнгер, А. Коулсон, 1975 г.) основан на ферментативных реакциях. На первом этапе осуществляют реакцию полимеризации с помощью ДНК-полимеразы I Е. coli (Poll) и всех четырех типов dNTP, один из которых радиоактивно мечен по альфа-положению фосфата. Синтез ведут в ограниченных условиях, с тем чтобы получить набор продуктов неполного копирования изучаемого одноцепочечного фрагмента. Затем полимерный материал отделяют от нуклеотидов, смесь делят на восемь частей и проводят дополнительные ПЦР либо в отсутствие одного из нуклеотидов при наличии остальных трех («минус»-система), либо в присутствии только одного («плюс»-система). 2. Метод Сэнгера. Как и в случае «плюс-минус»-метода, в его основу положено ферментативное копирование при помощи Poll исходного одноцепочечного сегмента ДНК с точки, задаваемой положением 3'-конца праймера. Специфическая терминация синтеза но-вых цепей ДНК обеспечивается добавлением в реакционную смесь кроме четырех типов dNTP (один из которых радиоактивно мечен по альфа-положению) синтетического аналога нуклеотида – 2',3'-дидезоксинуклеозидтрифосфата (ddNTP). Poll способна включать этот аналог в растущую цепь ДНК, однако, как только включение ddNTP произошло, дальнейшее наращивание цепи прекращается ввиду отсутствия в ddNTP З'-ОН- группы. 3. Метод Максама- Гилберта. Разработан в 1976 г. Метод применим к одно- или двухцепочечным фрагментам ДНК. Изучаемый полинуклеотид подвергают специфической химической фрагментации. Анализируемый фрагмент ДНК метится 32Р с одного конца (3' или 5') и разделяется на четыре аликвоты, в каждой из которых с помощью специфического химического воздействия полинуклеотидная цепь расщепляется по определенным нуклеотидам (Ц; Ц+Т; Г; Г+А); затем образовавшиеся фрагменты разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, что в конечном итоге по авторадиограмме позволяет расшифровывать нуклеотидную последовательность анализируемых фрагментов ДНК. За один цикл методом Максама-Гилберта обычно прочитывают не более 250-300 нуклеотидов, но при отлаженных процедурах можно одномоментно определить до 500 и более нуклеотидов. При секвенировании протяженных фрагментов ДНК их гидролизуют различными рестриктазами и расшифровывают последовательность нуклеотидов перекрывающихся субфрагментов. Для снижения вероятности ошибки обычно проводят секвенирование обеих взаимокомплементарных цепей фрагмента ДНК.


15. Опишите плюс-минус метод

Первый метод секвенирования ДНК (Ф. Сэнгер, А. Коулсон, 1975 г.) основан на ферментативных реакциях. Данный подход предполагает выделение одеоцепочечного фрагмента ДНК, соответствующего исследуемому участку генома. Этот фрагмент затем используют в реакции ПЦР в качестве матрицы, а в качестве праймера – синтетические олигонуклеотиды или природные субфрагменты, получаемые после гидролиза определенными рестриктазами. На первом этапе осуществляют реакцию полимеризации с помощью ДНК- полимеразы I E.coli и всех четырех типов dNTP, один из которых радиоактивно мечен по альфа- положению фосфата. Синтез ведкт в ограниченных условиях, с тем чтобы получить набор продуктов неполного копирования изучаемого одноцепочечного фрагмента. Затем полимерный материал отделяют от нуклеотидов, смесь делят на восемь частей и проводят дополнительные ПЦР либо в отсутствие одного из нуклеотидов при наличии остальных трех («минус»- система), либо в присутствии только одного («плюс»- система). В «минус»- системе ДНК- полимераза будет достраивать все новосинтезированные комплементарные матрице цепи до положения ближайшего нуклеотида, который отсутствует в реакционной смеси, и в этом месте синтез будет прекращаться. Т.о., терминация реакции полимеризации происходит во всех точках копируемых цепей перед отсутствующим в смеси нуклеотидом. В «плюс»- системе ДНК- полимераза проявляет два типа активностей: 1) 5 '-3 '-полимеразную, если добавленный в реакционную смесь единственный dNTP расположен в последовательности сразу за 3'-концом новосинтезированной цепи ДНК; 2) 3'-5'-экзонуклеазную, при этом фермент деградирует новосинтезированные цепи с 3'-конца до того места, где находится присутствующий в системе dNTP. В этой точке деградация цепи останавливается, и ДНК- полимераза начинает обменивать 3'-концевой нуклеотид на присутствующий в смеси. В «плюс»-системе терминация реакции происходит на последовательности после нуклеотида данного типа. Полученные описанным способом 8 образцов одновременно подвергают электрофоретическому разделению высокого разрешения, гель радиоавтографируют и с радиоавтографа читают последовательность нуклеотидов. Исходная последовательность комплементарна читаемой с радиоавтографа.



16. Опишите метод Сэнгера

Существенным недостатком «плюс-минус»-метода является то, что получить строго статистический набор продуктов ограниченного копирования на первой стадии очень трудно. Поэтому данный подход в 1977 г. сменился другим, разработанным в той же лаборатории, возглавляемой Ф. Сэнгером. Первоначально он получил название метода терминирующих аналогов трифосфатов (метод дидезоксинуклеозидтрифосфатов), а в настоящее время называется дидезокси-методом Сэнгера. Как и в случае «плюс-минус»-метода, в его основу положено ферментативное копирование при помощи ДНК- полимеразы I исходного одноцепочечного сегмента ДНК с точки, задаваемой положением 3'-конца праймера. Специфическая терминация синтеза новых цепей ДНК обеспечивается добавлением в реакционную смесь кроме четырех типов dNTP (один из которых радиоактивно мечен по альфа-положению) синтетического аналога нуклеотида – 2',3'-дидезоксинуклеозидтрифосфата (ddNTP). Poll способна включать этот аналог в растущую цепь ДНК, однако, как только включение ddNTP произошло, дальнейшее наращивание цепи прекращается ввиду отсутствия в ddNTP З'-ОН- группы.иОтношение концентраций dNTP/ddNTP подбирается экспериментально таким образом, чтобы терминация реакции полимеризации происходила вдоль копируемой цепи ДНК в среднем на каждом месте расположения нуклеотида, комплементарного использованному ddNTP. Образцы четырех реакционных смесей, содержащих по одному из типов ddNTP, наносят в соседние ячейки денатурирующего полиакриламидного геля (ПААГ) для фракционирования и после радиоавтографии геля читают последовательность с радиоавтографа. Метод Сэнгера значительно упростился и получил широкое распространение после появления векторной системы на основе нитевидного фага М13. Фаг М13 содержит в составе вирионов одноцепочечную кольцевую молекулу ДНК. При репликации в инфицированных клетках Е. coli молекула ДНК фага М13 проходит через стадию образования двухцепочечной репликативной формы, которую можно легко выделить и встроить в нее чужеродные фрагменты ДНК. Гибридные фаги в составе своих вирионов будут содержать одноцепочечную кольцевую молекулу ДНК, в которой в строго определенном месте находится одна из цепей встроенного фрагмента. Для секвенирования дидезокси-методом Сэнгера любой последовательности ДНК, клонированной в составе генома векторного фага M13, можно использовать один и тот же (универсальный) синтетический олигонуклеотидный праймер, комплементарный последовательности ДНК фага, прилегающей к участку встройки чужеродных фрагментов. При этом нет необходимости получать специфические праймеры для секвенирования каждого индивидуального фрагмента. Этот прием позволил многократно повысить скорость секвенирования. Как правило, этим методом с использованием универсального праймера удается секвенировать последовательность размером 250-400 нуклеотидов.


21. Объясните, что такое полимеразная цепная реакция.

1983 – Карл Мюллис изобрел ПЦР. ПЦР - метод амплификации ДНК in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определённую последовательность ДНК в миллиарды раз. Возможность получения огромного количества копий одного строго определённого участка генома значительно упрощает исследование имеющегося образца. ПЦР осущ-ют в амплификаторе с пом.спец-го термостабильного фермента ДНК-полимераза (Taq-полимеразы, Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и др.), ионов Mg2+, необходимых для работы полимеразы, набора всех четырех н/дов А, Т, Г и Ц и коротких олигонуклеотидных затравок – праймеров,. Важнейшая характеристика праймеров — температура плавления (Tm) комплекса праймер-матрица. Tm=2*(A+T)+4*(G+C)-2[°C]. Циклические стадии: 1. Денатурация. Инкубационную смесь, в к-й сод-ся образец нужной ДНК, нагревают до Tm , к-ю высчитывают по формуле, приведенной выше. При этом в течении 0,5-2' происходит разрушение слабых водородных связей между нитями ДНК, и из одной двухцепочечной молекулы обр-ся 2 одноцепочечные. 2. Аннилинг (гибридизация праймеров, ренатурация, отжиг). Когда цепи разошлись, t° понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. t° аннилинга зависит от состава праймеров и обычно выбирается равной t° плавления праймеров. Неправильный выбор t° приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей. Время стадии отжига30 cек. 3. Полимеризация (синтез, элонгация). ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, исп-я праймер в кач.затравки. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, к-ый связался с матрицей, и движется вдоль матрицы, синтезируя новую цепь в направлении от 5' к 3' концу. t° элонгации зависит от полимеразы. Часто исп-емые полимеразы Taq и Pfu наиб. активны при 72 °C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. В рез.кол.ДНК удваивается. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7—10 мин. Можно провести 30 и более циклов. ПЦР технологии позволили ученым без огромных временных и материальных затрат получать точные данные по структуре генов и фрагментов ДНК при наличии самого минимального количества биологического материала. ПЦР используют для сравнения так называемых «генетических отпечатков пальцев». Необходим образец генетического материала с места преступления — кровь, слюна, сперма, волосы и т. п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. ПЦР применяют в установлении отцовства, в медицинской диагностике, персонализированной медицине, клонировании ДНК, мутагенезе и т.д.



17. Объясните автоматическое секвенирование ДНК

Необходимость получения информации о последовательности нуклеотидов в ДНК во всевозрастающих масштабах поставила вопрособ автоматизации процесса секвенирования ДНК, поскольку применявшиеся до этого ручные методы уже не позволяли справляться с такими большими объемами работы. Под автоматическим секвенированием ДНК понимается в первую очередь электрофоретическое разделение меченых продуктов терминирующих реакций с помощью специальных приборов –автоматических секвенаторов ДНК. Автоматизации с помощью лабораторных биороботов подвергаются также процесс наработки матриц для их последующего ферментативного секвенирования и проведение секвенирующих реакций. Первый автоматический ДНК-секвенатор был разработан в 1987 г. фирмой Applied Biosystems (США). Для мечения вновь синтезируемых цепей ДНК в условиях терминации при автоматическом секвенировании используют молекулу какого-либо флуоресцирующего соединения. Принцип автоматического секвенирования ДНК заключается в электрофоретическом разделении флуоресцентно меченных продуктов специфически терминированных секвенирующих реакций и их детекции в режиме реального времени. Детекция осуществляется в нижней части геля, где в момент прохождения фрагментов ДНК происходит возбуждение молекул красителя лазерным лучом. Существуют различные схемы проведения терминирующих реакций и последующего разделения продуктов в секвенирующем гель- электрофорезе. Так, довольно обычным, в том числе и для неавтоматического секвенирования, является вариант, когда проводят 4 типа терминирующих реакций и разделяют продукты в четырех дорожках геля. При другом варианте (4 реакции/1 дорожка) также проводят 4 типа реакций, используя флуоресцентные метки с различными спектрами эмиссии. Разделение в этом случае возможно в одной дорожке геля. В результате экономится гелевое пространство и в 4 раза повышается производительность метода. Автоматические секвенаторы ДНК управляются специально созданными компьютерными программами. Так, например, приборы фирмы Applied Biosystems комплектуются программами сбора и анализа данных. После завершения электрофоретического разделения предварительные данные, собранные программой Data Collection, подвергаются анализу с помощью специальной программы. При этом определяется относительная высота пиков, соответствующих фрагментам ДНК, терминированным тем или иным типом нуклеотидного основания, и ликвидируются некоторые погрешности. В автоматическом секвенировании ДНК для разделения флуоресцентно меченных продуктов терминирующих реакций, кроме электрофореза в стандартных пластинах полиакриламидного геля, широко используется капиллярный гель-электрофорез. Для него характерны высокая чувствительность и высокая скорость разделения, являющиеся следствием крайне малого внутреннего диаметра самого капилляра. В ранних работах по секвенирующему капиллярному электрофорезу гелевым матриксом служил обычный полиакриламидный гель. Однако его нестабильность, формирование пузырьков воздуха, видимых при микроскопическом исследовании капилляров, заметно снижали производительность метода. Применение линейного полиакриламида позволило снять эти проблемы и способствовало развитию данного метода. Современные автоматические секвенаторы несравнимо превосходят человека по производительности, более того, каждый год такие автоматы удается улучшать. Все это ведет к тому, что секвенирование фрагментов ДНК становится простой процедурой, доступной в любой молекулярно-биологической лаборатории.
34. Опишите метод микроинъекции вирусных молекул ДНК.

Микроинъекция вирусных молекул ДНК. Метод впервые воспроизведен А. Грессманом в 1970 г. при введения молекул ДНК в культивируемые клетки млекопитающих. Процедура заключается во введении в клетку (цитоплазму или ядро) малых объемов жидкости (около 10-8 мкл) с помощью стеклянного микрокапилляра. Эксперимент проводится на предметном столике микроскопа с применением микроманипуляторов и микрошприцев. Используя эту методику, удалось изучить биологическую активность молекул ДНК разных вирусов. К достоинствам метода относится то, что определенное количество препарата ДНК можно ввести в выбранную область клетки, в частности в ядро. Недостатком метода является его сложность и невысокая производительность. Кроме того, по-видимому, он применим лишь к небольшим молекулам ДНК, так как при продавливании через микрокапилляр целостность больших молекул ДНК будет нарушаться вследствие гидродинамического сдвига.

С появле­нием   прибора   для   изготовления   микропипеток  диаметром 0,1—0,5 микрона и микроманипулятора появилась возможность введения чужеродной ДНК в культивируемые клетки путем прямой микроинъекции в ядро. Так, плазмиды, содержащие фрагмент вируса герпеса с геном тимидинкиназы и плазмиды pBR 322, были инъецированы в тк-клетки и было показано, что тк-ген проник в ядра и нормально в них реплицировался.



В принципе, при наличии хорошего оборудования можно за 1 ч инъецировать 500—1000 клеток, причем в лучших экспери­ментах в 50% клеток наблюдается стабильная интеграция и экспрессия инъецированных генов. Преимущество описываемо­го метода заключается также в том, что он позволяет вводить любую ДНК в любые клетки, и для сохранения в клетках вве­денного гена не требуется никакого селективного давления.


18. Объясните, что представляют собой базы данных нуклеотидных и аминокислотных последовательностей

Нарастающее число секвенированных нук­леотидных последовательностей, принадлежа­щих разным организмам, заставило задуматься об упорядочении их хранения, что привело к со­зданию «коллекций» таких последовательнос­тей. Первая электронная база данных Los Ala­mos DNA Database, содержащая информацию о секвенированных последовательностях ДНК, была организована У. Гоадом и его коллегами в Лос-Аламосской национальной лаборатории (LANL) в США. В 1982 г. на ее основе под патронажем Национального инс­титута здоровья (NIH) был организован новый банк данных генетических последовательнос­тей GenBank. GenBank является американской базой дан­ных и финансируется правительством США, хотя и содержит информацию, собранную со всего мира. Созданная в 1980 г. в Европе анало­гичная база данных EMBL Data Library явилась первым международным хранилищем инфор­мации о последовательностях ДНК. Основные цели, преследовавшиеся при ее организации, — это обеспечение бесплатного доступа к коллек­ции опубликованных нуклеотидных последова­тельностей, выработка определенных стандар­тов и развитие информационного и компьютер­ного обеспечения проводимых молекулярно- биологических исследований. В 1994 г. база данных EMBL Data Library трансформировалась в EMBL Nucleo­tide Sequence Database и стала курироваться Ев­ропейским институтом биоинформатики (Euro­pean Bioinformatics Institute, или EBI). С 1986 г. в Японии начал функционировать банк данных DDBJ (DNA Data Bank of Japan). В 1995 г. в Японии был создан Центр информа­ционной биологии (CIB), и DDBJ, организован­ный ранее по инициативе Национального инс­титута генетики, перешел к нему в подчинение. В настоящее время действует International Nucleotide Sequence Database (INSD), возник­шая в результате сотрудничества между Gen­Bank, EMBL и DDBJ. Главными составляющи­ми этого сотрудничества являются единые тре­бования, предъявляемые к авторам при занесе­нии ими нуклеотидных последовательностей, присвоение единых для этих банков инвентар­ных номеров, регулярный ежедневный обмен информацией о новых нуклеотидных последо­вательностях. GenBank обычно присваивает инвентарный номер какой-либо нуклеотидной последова­тельности в течение нескольких рабочих дней с момента получения. Инвентарные номера ра­нее состояли из одной буквы и пяти цифр (на­пример L22579), однако бурный рост числа сек­венированных фрагментов ДНК привел к необ­ходимости перейти к новой системе, и теперь номера включают 2 буквы и 6 цифр (например AF380138). Следует отметить, что присвоенные ранее номера остаются шестисимвольными и их трансформация в восьмизначные прово­диться не будет. Вслед за отказом многих научных журналов публиковать в оригинальных статьях последовательности нуклеотидов, ограничиваясь только их инвен­тарными номерами в соответствующем между­народном банке данных, роль этих банков как источников информации существенно возросла. В настоящее время возникла парадоксальная ситуация, когда для большого числа генов из­вестна последовательность нуклеотидов, но о функции этих генов или ничего не известно, или известно очень мало. Крупнейшей базой данных аминокислотных последовательностей является SWISS-PROT, существующая с 1986 г. Банки нуклеотидных последовательностей ДНК и аминокислотных последовательностей белков, снабженные соответствующими компьютерны­ми программами, обеспечивают возможность сравнивать расшифрованные последовательнос­ти генов и их белковых продуктов с уже извест­ными, что по мере накопления информации все с большей достоверностью позволяет предска­зывать функции анализируемых белков.
40. Опишите эмбриональные стволовые клетки.

При создании трансгенных животных используют плюрипотентные эмбриональные стволовые клетки (ES-клетки), взятые из бластоцисты. ES-клетки можно культивировать in vitro и после необходимых манипуляций вернуть в организм, инъецируя их в бластоцисту. Клетки колонизируют эмбрион и участвуют в его нормальном развитии, давая начало клеткам всех типов соматических тканей и нередко клеткам зародышевого пути. Прежде чем инъецировать ES-клетки в бластоцисту, в них вводят целевые трансгены — либо путем трансфекции, либо инфицируя их рекомбинантными ретровирусами. Достоинство схемы в том, что она дает возможность проводить селекцию трансформированных ES-клеток по определенному параметру. Это может быть число копий трансгена, его хромосомная локализация или характер экспрессии. Все получаемые по такой схеме первичные трансгенные животные — мозаичные организмы, которые состоят из содержащих и не содержащих трансген клеток; поэтому для получения чистых трансгенных линий необходима селекционная работа. Иногда ES-клетки оказываются не способными колонизировать зародышевые ткани, что объясняется накоплением хромосомных нарушений в процессе культивирования и селекции in vitro. Проблему мозаичности первичных трансгенных животных можно преодолеть, если использовать трансформированные и прошедшие селекцию ES-клетки в качестве доноров ядер. Ядра ES-клеток, несущие трансгены, способны колонизировать энуклеированные ооциты, которые затем продолжают свое нормальное развитие. В результате может получиться животное, в каждой клетке которого будет содержаться трансген



19. Представьте известные геномные проекты.

Разработка методов секвенирования сделала возможным определение нуклеотидных последовательностей крупных молекул ДНК, а не только их фрагментов. В 1978 г.Ф. Сэнгер с соавторами опубликовали первую полную последовательность геномной одноцепочечной ДНК бактериофага 0X174, имеющей размер 5386 нуклеотидов. Следующий рубеж был преодолен при определении нуклеотидной последовательности митохондриальной ДНК человека (16 569 пн) в 1981 г. В 1992 г. С. Н. Щелкунов с соавторами вручную методом Максама-Гилберта секвенировали геном вируса натуральной оспы (186 тпн). Появление высокопроизводительных методов секвенирования ДНКпозволило определять последовательности более крупных геномов. Значительная роль в этом принадлежит автоматизации всего процесса секвенирования. В июле 1995 г. Была опубликована первая нуклеотидная последовательность полного генома (1 830 137 пн) самостоятельно существующего организма — грамотрицательной бактерии Haemophilus influenzae. Геном этой бактерии характеризуется относительно низким содержанием GC-nap (38 %). На основании полученных данных была составлена кольцевая карта хромосомы Н. influenzae. В 1997 г. усилиями нескольких научных центров США и Мексики удалось секвенировать полный геном (4 639 221 пн) другой грамотрицательной бактерии — Escherichia coli К-12 (штамм MG1655). Содержание GC-nap в геноме Е. coli составило 50,8 %. Компьютерный анализ выявил 4288 потенциальных открытых рамок считывания. Первым эукариотическим организмом,полная последовательность которого (12 млн 68 тыс. пн) была определена в 1996 г., стали дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Огромные успехи в расшифровке последо-вательности молекул ДНК привели к тому, что в 1990 г. в США была принята официальная программа по расшифровке генома человека,в рамках которой планировалось при вложении 3 млрд долларов США завершить секвенирование полного генома человека в течение 15 лет. Основным исполнителем HGP стала компания Celera Genomics. Аналогичные проекты по геному человека также начали реализовываться в Западной Европе, Японии и России. В 2001 г. участники американской программы HGP и Международного консорциума по секвенированию генома человека, объединяющего многочисленные научные организации США, Великобритании, Германии, Франции,Японии и Китая, независимо объявили о завершении секвенирования большей части (более 95 %) генома человека. На основании полученных данных стало возможным сделать ряд выводов об организации генома человека. Компанией Celera Genomics в рамках проекта по секвенированию генома человека использовалось пять образцов человеческой ДНК от двух женщин и трех мужчин. Среди этих

людей были один афроамериканец, один китаец, один испано-мексиканец и двое европейцев На основании данных секвенирования образцов ДНК была рассчитана:последовательность генома человека длино12,91 млрд пн. Компьютерный анализ позволил обнаружить 26 588 транскрибируемых и транслируемых в белки генов.Экзоны занимаю лишь 1,1 % генома, в то время как интроны -24 %. Остальная часть генома (75 %) представлена межгенными последовательностями

Широкое развитие получили также проекты по секвенированию и анализу полных геномов патогенных микроорганизмов . В ближайшие годы планируется расшифровать структуру геномов более чем 100 видов болезнетворных микроорганизмов. Секвенированных вирусных геномов уже насчитывается более 600.

Накапливаемая информация позволяет выяснять молекулярные механизмы патогенного действия микроорганизмов на инфицируемый организм. Это создает базу знаний, необходимых для эффективной разработки современных средств и методов лечения инфекционных заболеваний.
42. Обоснуйте использование трансгенных животных в фундаментальных исследованиях.

Трансгенная технология несет в себе большие возможности, в первую очередь для фундаментальных научных исследований. Эксперименты с трансгенными мышами призваны обеспечить прогресс в молекулярной биологии и генетике млекопитающих. Этому способствует развитие следующих направлений научного поиска: • анализ цис-действующих контролирующих элементов, ответственных за тканевую специфичность — временную и физиологическую регуляцию экспрессии генов; • анализ физиологических последствий (на уровне целого организма) различных отклонений в экспрессии генов, в том числе онкогенов; • получение случайных новых мутантов, возникающих в популяции трансгенных мышей в результате внедрения трансгена в последовательность того или иного функционального гена (мутировавший ген можно выделить, используя трансген в качестве гибридизационной пробы); • получение мутантов с направленно инактивированными генами — так называемых нокаутных (от англ. knock out — выбить) животных.



20. Объясните метод амплификации последовательностей in vitro.

Амплификация в молекулярной биологии — увеличение числа копий ДНК. Наиболее распространенный метод увеличения числа копий ДНК in vitro — ПЦР. 1983 – Карл Мюллис изобрел ПЦР. Исп-е ПЦР методики позволяет амплифицировать (размножать) ДНК или её фрагмент in vitro увеличивая кол.копий в миллионы раз за неск.часов. ПЦР осущ-ют в амплификаторе с пом.спец-го термостабильного фермента ДНК-полимераза (Taq-полимеразы, Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и др.), ионов Mg2+, необходимых для работы полимеразы, набора всех четырех н/дов А, Т, Г и Ц и коротких олигонуклеотидных затравок – праймеров,. Важнейшая характеристика праймеров — температура плавления (Tm) комплекса праймер-матрица. Tm=2*(A+T)+4*(G+C)-2[°C]. Верхний предел t°плавления ограничен оптимумом t действия полимеразы, активность к-й падает при t°> 80 °C. ПЦР протекает в три циклические стадии, к-м предшествует стадия общей денатурации ДНК (t=94°С). Для остановки ПЦР температуру снижают до +4°С, при к-й Taq-полимераза теряет активность.



Циклические стадии: 1. Денатурация. Инкубационную смесь, в к-й сод-ся образец нужной ДНК, нагревают до Tm , к-ю высчитывают по формуле, приведенной выше. При этом в течении 0,5-2' происходит разрушение слабых водородных связей между нитями ДНК, и из одной двухцепочечной молекулы обр-ся 2 одноцепочечные. 2. Аннилинг (гибридизация праймеров, ренатурация, отжиг). Когда цепи разошлись, t° понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. t° аннилинга зависит от состава праймеров и обычно выбирается равной t° плавления праймеров. Неправильный выбор t° приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей. Время стадии отжига30 cек. 3. Полимеризация (синтез, элонгация). ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, исп-я праймер в кач.затравки. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, к-ый связался с матрицей, и движется вдоль матрицы, синтезируя новую цепь в направлении от 5' к 3' концу. t° элонгации зависит от полимеразы. Часто исп-емые полимеразы Taq и Pfu наиб. активны при 72 °C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. В рез.кол.ДНК удваивается. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7—10 мин. Можно провести 30 и более циклов. Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен кол-м реагентов, присутствием ингибиторов, обр-м побочных прод-в. На посл.циклах р-ции рост замедляется, это называют «эффектом плато».

ПЦР технологии позволили ученым без огромных временных и материальных затрат получать точные данные по структуре генов и фрагментов ДНК при наличии самого минимального количества биологического материала. ПЦР используют для сравнения так называемых «генетических отпечатков пальцев». Необходим образец генетического материала с места преступления — кровь, слюна, сперма, волосы и т. п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. ПЦР применяют в установлении отцовства, в медицинской диагностике, персонализированной медицине, клонировании ДНК, мутагенезе и т.д.


36. Опишите котрансформацию.

В независимых экспериментах доказано, что если в составе одной гибридной плазмиды объединить ген тимидинкиназы и неселектируемую последовательность, то в отобранных ТК-клонах в геноме клетки наряду с селектируемым маркером будет находиться в интегрированном состоянии и ковалентно связанный с ним в плазмиде ген. Одновременно ряд авторов обнаружили , что при введении в клетки животных совместно с геном тимидинкиназы любых других ковалентно не связанных молекул ДНК в трансформантах ТК+ данные последовательности выявляются с большей частотой. Это обусловлено тем, что в популяции клеток имеется лишь незначительная субпопуляция компетентных клеток, которые в силу своего физиологического состояния с большей частотой , чем другие клетки, поглощают вводимую биохимическим методом экзогенную ДНК независимо от ее природы. Если клетки обрабатывать смесью двух препаратов ДНК , то в высококомпетентные клетки с большой вероятностью попадают молекулы ДНК обоих типов. Проникшая чужеродная гентическая информация интегрируется в геном клетки. По аналогии с совместной трансформацией бактериальных клеток плазмидными ДНК обнаруженное явление было названо котрансформацией.

Метод котрансформации был разработан для введения и экспрессии в клетках млекопитающих последовательностей ДНК, не кодирующих никаких селектируемых маркеров. Чтобы получить коитраисформанты, реципиеитные клетки инкубируют с донорной ДНК и одновременно с другой ДНК, кодирующей какой-либо селектируемый маркер, например содержащий tk-rew HSV. Трансформацию реципиентных клеток и отбор проводят как обычно. Отбирают ТК+-трансформанты и про­веряют их на котрансформацию методом гибридизации с гиб- ридизационной пробой или каким-либо другим доступным ме­тодом.

Опыты по котрансформации с tt-геном HSV-1 и бактерио­фагом 0X174, или плазмидой pBR322, или клонированным ге­ном р-глобина кролика [14] позволили получить линии мыши­ных клеток, содержащих множественные копии ^трансформи­рующих генов. Частота котрансформации очень велика: ко- трансформирующую ДНК содержат свыше 90% трансформан­тов. С помощью такой системы котрансформации можно осу­ществить введение и стабильную интеграцию практически лю­бого выбранного гена в культивируемые клетки, не прибегая к «сшиванию» данного гена с ДНК какого-либо вектора или с генами, кодирующими биохимически селектируемые маркеры.


22. Приведите примеры использования ПЦР.

1983 – Карл Мюллис изобрел ПЦР. ПЦР - метод амплификации ДНК in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определённую последовательность ДНК в миллиарды раз. Возможность получения огромного количества копий одного строго определённого участка генома значительно упрощает исследование имеющегося образца. ПЦР осущ-ют в амплификаторе с пом.спец-го термостабильного фермента ДНК-полимераза (Taq-полимеразы, Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и др.), ионов Mg2+, необходимых для работы полимеразы, набора всех четырех н/дов А, Т, Г и Ц и коротких олигонуклеотидных затравок – праймеров.

ПЦР технологии позволили ученым без огромных временных и материальных затрат получать точные данные по структуре генов и фрагментов ДНК при наличии самого минимального количества биологического материала. ПЦР используют для сравнения так называемых «генетических отпечатков пальцев». Необходим образец генетического материала с места преступления — кровь, слюна, сперма, волосы и т. п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. ПЦР применяют в установлении отцовства, в медицинской диагностике(диагностика наследственных и инфекцион-х заб-й), персонализированной медицине, клонировании ДНК, мутагенезе и т.д. ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных и инфек-х заболеваний. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а затем секвенируют для определения мутаций. Инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы заболевания.

Плюсы ПЦР диагностики:

1. Широта диагностических возможностей - с помощью ПЦР можно определять все виды вирусных, бактериальных и грибковых инфекций.

2. Доступность - сегодня ПЦР проводится в любой клинике.

3. ПЦР может использовать для анализа любые образцы тканей или биологических жидкостей.

4. ПЦР - очень точный метод. Другой метод, применяющийся для диагностики инфекции, называемый ИФА, в 30-40% случаев, по данным различных исследований, не обнаруживает возбудителя.

5. ПЦР определяет самого возбудителя, в отличие от серологических методов. (Серологические методы основаны на определении антигенов или антител к возбудителю в сыворотке крови. Для этого инфекция должна какое-то время существовать в организме больного. Например, первые месяцы после заражения ВИЧ, серологические методы не дают положительных результатов, несмотря на то, что болезнь уже началась. ПЦР лишена этого недостатка).

6. ПЦР - высокоспецифичный метод. У него нет таких недостатков, как ложно-положительные или ложно-отрицательные результаты. Ошибки метода полимеразной цепной реакции скорее зависят от человеческого фактора.
23. Объясните использование ПЦР для клонирования заданных фрагментов ДНК.

1983 – Карл Мюллис изобрел ПЦР. ПЦР - метод амплификации ДНК in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определённую последовательность ДНК в миллиарды раз. Возможность получения огромного количества копий одного строго определённого участка генома значительно упрощает исследование имеющегося образца. ПЦР осущ-ют в амплификаторе с пом.спец-го термостабильного фермента ДНК-полимераза (Taq-полимеразы, Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и др.), ионов Mg2+, необходимых для работы полимеразы, набора всех четырех н/дов А, Т, Г и Ц и коротких олигонуклеотидных затравок – праймеров,. Важнейшая характеристика праймеров — температура плавления (Tm) комплекса праймер-матрица. Tm=2*(A+T)+4*(G+C)-2[°C]. Циклические стадии: 1. Денатурация. Инкубационную смесь, в к-й сод-ся образец нужной ДНК, нагревают до Tm , к-ю высчитывают по формуле, приведенной выше. При этом в течении 0,5-2' происходит разрушение слабых водородных связей между нитями ДНК, и из одной двухцепочечной молекулы обр-ся 2 одноцепочечные. 2. Аннилинг (гибридизация праймеров, ренатурация, отжиг). Когда цепи разошлись, t° понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. t° аннилинга зависит от состава праймеров и обычно выбирается равной t° плавления праймеров. Неправильный выбор t° приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей. Время стадии отжига30 cек. 3. Полимеризация (синтез, элонгация). ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, исп-я праймер в кач.затравки. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, к-ый связался с матрицей, и движется вдоль матрицы, синтезируя новую цепь в направлении от 5' к 3' концу. t° элонгации зависит от полимеразы. В рез.кол.ДНК удваивается. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7—10 мин.



Использование ПЦР для клонирования заданных фрагментов ДНК. Появление метода ПЦР значительно упростило процедуру точного извлечения из состава молекул ДНК известных нукл.последовательностей. Могут быть рассчитаны послед-ти олигонукл-х праймеров, которые обеспечивают не только точную амплификацию требуемого фрагмента, но и одновременно позволяют вводить участки гидролиза опред-х рестриктаз, необходимые для запланированной встройки в клонирующий вектор. При этом кол-во исходной ДНК, содержащей целевую последовательность, может быть очень малым.


24. Опишите применение олигонуклеотидных микрочипов.

В 1988 г.группой ученых Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН была инициирована разработка олигонуклеотидных, иначе называемых олигонуклеотидными

микроматрицами. Целью этого исследования была разработка метода, позволяющего секвенировать короткие фрагменты ДНК путем гибридизации с олигонуклеотидами известной последовательности, которые иммобилизованы на твердом носителе в строго определенном порядке (это и называется микрочипом).В дальнейшем благодаря созданию специального оборудования удалось роботизировать процесс получения микрочипов с нанесением в строго определенном порядке микроколичеств олигонуклеотидов или фрагментов ДНК на твердый носитель (обычно исполь-зуют стекло, нейлоновые мембраны и др.). Препараты ДНК, предназначенные для гибридизации на микрочипе,флуоресцентно метят, обычно в процессе ПЦР.После гибридизации и отмывки микрочип анализируют с помощью лазерного сканера и данные флуоресценции каждой ячейки микроматрицы подвергают компьютерной обработке, используя специальное программное обеспечение. Секвенирование многочисленных кДНК и полных геномов создало базу для получения микрочипов, позволяющих одновременно изучать экспрессию большого числа генов на уровне целого генома. Первую работу данного направления выполнили М. Шен с сотрудниками (1995 г.), создав микрочип на основе амплифицированных в ПЦР фрагментов кДНК для 48 генов растения Arabidopsis thaliana. Из листьев и корней растений выделяли суммарную мРНК, флуоресцентно метили в реакции обратной транскрипции и гибридизовали с созданным микрочипом. Результаты анализа продемонстрировали, что экспрессия изученных генов в листьях и корнях одного и того же растения различается. Технология ДНК-микрочипов дает мощный инструмент для анализа функционирования генов не только в системе in vitro, но и в живом организме в зависимости от различных физиологических и патологических состояний. Так, К. Бигер с соавторами (2001 г.) в течение 14 недель прижизненно изучали экспрессию многочисленных генов в печени шимпанзе, инфицированной вирусом гепатита С. Материала игольной биопсии было достаточно для выделения суммарной мРНК, мечения флуоресцентным красителем ДНК-копий и гибридизации на микрочипе, содержащем кДНК набора генов человека. Технология ДНК-микрочипов является чрезвычайно эффективным для использования в диагностической практике в целях идентификации инфекционных агентов и различных неинфекционных заболеваний. В перспективе будут созданы микроматрицы для одновременного выявления большинства известных инфекционных агентов (вирусов, бактерий,простейших и т. п.).
26. Объясните иммуноблотинг.

Иммуноблоттинг- анализ смеси белков, перенесенных на твердую подложку-мембрану, с которой они связываются ковалентными связями, с последующей иммунодетекцией. Анализировать можно смесь белков, нанесенную на подложку, — дот-блот анализ,— либо после ее предварительного фракционирования методам электрофореза — Вестерн-блот ана-



лиз . Иммуноблот – это один из методов лабораторной диагностики, который широко используется в диагностике вирусных инфекций человека, в том числе и ВИЧ. Для проведения иммуноблотинга на первом этапе белки, содержащиеся в сыворотке крови, разделяют в геле по их молекулярной массе и заряду с помощью электрического поля (методом электрофореза в геле). Наиболее распространенный способ разделения белков ПААГе в присутствии додецилсульфата натрия . SDS вызывает денатурацию белков и поддерживает их в денатурированном состоянии, для разрушения вторичных и третичных структур белков используют восстановители дисульфидных связей, например, меркаптоэтанол. Белки вместе с полоской геля переносят на мембрану, изготовленную из нитроцеллюлозы или нейлона. Мембрана накладывается поверх геля, а поверх неё кладут стопку фильтровальной бумаги. Всю стопку помещают в буфер для переноса, который продвигается верх по бумаге под действием капиллярных сил, уносит с собой белки. Это осуществляют в специальной камере, которая позволяет осуществить полный перенос материала из геля на мембрану. Эффективность переноса белков из геля на мембрану может быть проверена окрашиванием мембраны красителями. Первоначально мембрану обрабатывают антителами к искомому антигену, а после отмывки несвязанного материала, добавляют радиоактивно меченный коньюгат, который специфически связывается с антителами (как в ИФА). Местоположение образующегося комплекса антиген - антитело - меченый коньюгат определяют с помощью авторадиографии с использованием рентгеновской пленки. После ее проявления все становится ясным, есть антигены в крови или их нет.



Каталог: uploads
uploads -> Представление
uploads -> Городу иркутску 355 лет Иркутский хронограф
uploads -> Лекция «Здравоохранение Амурской области»
uploads -> Закон о промышленной безопасности опасных
uploads -> Литература О. Николенко п. 1 читать, п. 2-4 конспект; читать Педро Кальдерон "Життя-це сон"
uploads -> Дрижд николай александрович
uploads -> Становление советского флота
uploads -> Грузовое судно, которое частично использует солнечную энергию, было построено японскими судостроителями на верфи «Imabari Shipbuilding Industry Ltd»


Поделитесь с Вашими друзьями:
1   2   3   4


База данных защищена авторским правом ©grazit.ru 2019
обратиться к администрации

войти | регистрация
    Главная страница


загрузить материал