1. Представьте строение и свойства молекулы ДНК


Опишите блотинг по Саузерну



страница4/4
Дата07.06.2018
Размер1.92 Mb.
1   2   3   4
25. Опишите блотинг по Саузерну.

Саузерн блоттинг — метод, применяемый в моле.био-и для выявления определенной посл-ти ДНК в образце. Метод Саузерн блоттинга сочетает электрофорез в агарозном геле для фракц- я ДНК с методами переноса разделенной по длине ДНК на мембранный фильтр для гибридизации. Метод: 1.Рестрикция эндонуклеазами рестрикции для разрезания  ДНК на мелкие фрагменты 2.Фрагменты ДНК подвергаются электрофорезу в агарозном геле для разделения по длине 3.В случае, если некоторые фрагменты ДНК длиннее 15 кб, перед переносом гель обрабатывают, н-р, соляной кислотой, которая вызывает депуринизацию ДНК и облегчает перенос на мембрану 4.В случае, когда используют щелочной метод переноса, агарозный гель помещают в щелочной раствор, при этом двойная спираль ДНК денатурирует и облегчает связывание отрицательно заряженной ДНК с положительно заряженной мембраной для дальнейшей гибридизации. 5.Листок нитроцеллюлозной мембраны помещают сверху или снизу от агарозного геля. Давление осуществляют непосредственно на гель или через несколько слоев бумаги. Буфер переносится капиллярными силами из участка с высоким содержанием воды в зону с низким содержанием воды (мембрана). При этом осуществляется перенос ДНК из геля на мембрану. ДНК связывается с положительно заряженной мембраной силами ионообменных взаимодействий. Для окончательного закрепления ДНК на мембране, последняя нагревается в вакууме до температуры 80 °C в течение двух часов. ДНК, связанную с мембранной, можно гибридизовать с радиоактивно меченным зондом,специфичным к определенной последовательности. В качестве такого зонда можно использовать клонированный фрагмент ДНК, синтетический олигонуклеотид, РНК или ее ДНК-копию. Меченый зонд гибридизуется с ДНК, содержащей комплементарные ему последовательности . Полосы гибридизовавшейся ДНК выявляются после радиоавтографии мембраны. Результаты: Гибридизация пробы со специфическим участком ДНК, закрепленным на мембране, указывает на наличие анализируемой последовательности нуклеотидов в пробе. Применение. Саузерн блоттинг может быть использован для определения числа копий генов в геноме. Проба, к-я гибридизуется только с единственным фрагментом ДНК, который не был разрезан рестриктазами, дает одну полосу на Саузерн-блоте, в то время как множественные полосы на блоте указывают на то, что проба гибридизовалась с несколькими идентичными последовательностями.


54. Опишите вирус мозаики коровьего гороха.

СPMV инфицирует бобовые растения, его природным хозяином является коровий горох. Геном CPMV состоит из двух одноцепочечных молекул РНК размером около 6 (РНК1) и 3,5 тыс.(РНК2) нуклеотидов . Каждая из этих РНК кодирует по одному полипротеину-предшественнику, из к-х в рез.специфического процессинга обр-ся зрелые белки. Кодируемые РНК1 белки обеспечивают ф-ции репликации и протеолитического процессинга полипротеинов, РНК2 кодирует белки, необходимые для сборки капсида и р-нению вирионов по растению. Икосаэдрический капсид CPMV состоит из двух белков: L и S, каждый из к-х представлен 60 копиями. Организация этих белков изучена подробно, что позволило встраивать чужеродные последовательности без нарушения сборки вирионов и их р-нения в р-х.

Петля βВ-βС белка S нах-ся на поверх.вириона и наиб.вариабельна по а/к-й последовательности в разных штаммах CPMV. Логично, что изменения последовательности в этом районе белка S допустимы. В этот район и встраиваются последовательности целевых белков. Химерные вирионы показали высокую иммуногенность.

Существуют ограничения по размеру вставки. Кроме того, вирусная система не обеспечивает наследования растениями экзогенной РНК: продукция вируса и экспрессия встроенного целевого гена возможна только в инфицированных растениях в ограниченных промежуток времени. Главными недостатками вирусной системы экспрессии в р-х явл.опасность р-нения этих вирусов в окр.среде насекомыми, мех-ми и др.способами.




27. Как проводят введение плазмидных и фаговых молекул ДНК в клетки E.coli.

E.coli –граммотрицательная бактерия,относится к тем микроорганизмам, которые не обладают физиологической компетентностью к поглощению экзогенных молекул ДНК. Поэтому для введения ДНК внутрь данной бактерии необходимо создать условия, позволяющие преодолеть барьер клеточной стенки. Первые успехи на этом пути были достигнуты в 1960-е гг. при анализе инфекционности фаговых ДНК в системе сферопластов Е. coli. Сферопласты обычно получают путем обработки бактериальных клеток в растворе лизоцимом,являющимся бактерицидным ферментом, который содержится в слезной жидкости, носовой слизи, яичном белке, клетках бактерий и т. д. Лизоцим, эффективно гидролизующий пептидогликан грамположительных клеток, в тех же условиях не деградирует пептидогликановый слой грамотрицательных бактерий, поскольку не может проникнуть через внешнюю мембрану клетки. Липополисахаридный слой внешней мембраны грамотрицательных бактерий стабилизирован двухвалентными катионами, и поэтому для «разрыхления» внешней мембраны используют агент ЭДТА (этилендиаминтетраацетат), связывающий двухвалентные катионы. В результате обработки ЭДТА часть липополисахаридов высвобождается из внешней мембраны клетки, и лизоцим после этого способен достигать пептидогликанового слоя и гидролизовать его. Лизоцим расщепляет

в пептидогликане гликозидную связь между углеродом С1 N-ацетилглюкозамина и С4 N-аце-

тилмурамовой кислоты. Метод получения сферопластов Е. coli позволили достичь достаточно высокой эффективности трансфекции молекулами ДНК различных фагов. Хотя ЭДТА-лизоцимные сферопласты Е. coli в некоторых экспериментах могут обеспечивать высокую эффективность трансфекции фаговыми ДНК, процесс их получения многостадиен и дает плохо воспроизводимые результаты. Поэтому данный методический подход не нашел широкого применения. Начиная с 1970 г. его почти полностью вытеснил метод СаСl2-зависимой трансфекции клеток Е. coli, который разработали М. Мандель и А. Хига. Они обнаружили, что обработка культуры Е. coli раствором СаСl2 на холоде (0 °С) с последующим тепловым шоком (37 °С) приводит к поглощению клетками добавленных в среду молекул ДНК фага А и завершается образованием инфекционного фагового потомства. Метод оказался крайне простым и воспроизводимым. Также в настоящее время разработан физический метод введения экзогенных молекул ДНК в клетки Е. coli — электропорацией.

Более прост в исполнении и дает очень высокий результат: до 80 % выживших клеток Е. coli могут поглотить молекулы ДНК при этом 1 трансформант может быть получен на 50 молекул плазмиды.

Для фага , часто используемого в качестве молекулярного вектора клеток Е. coli, разработан метод упаковки ДНК in vitro в капсиды. Для этого требуются концентрированные экстракты клеток, индуцированных из лизогенного состояния. Используются мутанты фага, имеющие дефекты по разным генам белков головки капсида. Каждый из таких мутантов не способен образовывать полноценные фаговые частицы и упаковывать свою ДНК. При смешении же фаговой ДНК и белковых экстрактов клеток, в которых развивались мутанты, происходит комплементация недостающих функций и собираются инфекционные частицы. Биологическую активность эндогенной фаговой ДНК в экстрактах обычно подавляют УФ-облучением. Сформированными in vitro частицами можно заражать клетки Е. coli и получать фаговое потомство. Создание методов введения в клетки Е. coli плазмидных и фаговых ДНК в нативной форме явилось необходимым условием успешного развития работ поклонированию чужеродной генетической информации в этих клетках.


30. Объясните конструирование плазмид pBR325.

Хотя pBR322 отвечает многим требованиям, предъявляемым к клонирующим векторам, она имеет и некоторые недостатки. При встройке фрагментов ДНК по EcoRI- месту плазмиды pBR322 гибридные клоны нельзя выявить фенотипически на средах с антибиотиками. Чтобы преодолеть этот недостаток , была сконструирована плазмида pBR325. При ее создании использовали ДНК фага P1Cm(r), содержащего ген устойчивости к хлорамфениколу (ген хлорамфениколацетилтрансферазы – cat). Рестриктазой HaeII из фаговой ДНК выщепляли фрагмент, содержащий ген cat. Заетм нуклеазой S1 гидролизовали липкие концы, образованные HaeII, и получали фрагмент с тупыми концами. Этот фрагмент лигировали с расщепленными EcoRI и обработанными S1-нуклеазой линейными молекулами плазмиды pBR322 . После трансформации клеток E.coli отбирали клоны с фенотипом Ap(r)Tc(r)Cm(r). Полученная таким образом плазмида pBR325 имеет единственное место гидролиза рестриктазой EcoRI в гене cat. Встройка по этому месту нарушает ген устойчивости к хлорамфениколу, и гибридные клоны легко выделяются по фенотипу Ap(r)Tc(r)Cm(r). Плазмида pBR325 в отличие от pBR322 имеет уже два места действия рестриказ PvuII и BalI, причем по одному из них приходится на ген cat. Остальные уникальные места узнавания рестриктаз плазмиды pBR322 сохранены и в pBR325.



28. Опишите метод электропорации.

Способы прямого введения генов в клетку:

Трансфекция; Микроинъекция; Электропорация

Метод «мини-клеток»; Упаковка в липосомы; Электронная пушка.

Электропорация основана на том, что импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран. В среду для электропорации добавляют клетки и фрагменты ДНК, которые необходимо ввести в клетки. Через среду пропускают высоковольтные импульсы (напряжение 200 - 350 В, длительность импульса 54 мс), приводящие к образованию пор (электропробой) в цитоплазматической мембране, время существования и размер которых достаточны, чтобы такие макромолекулы, как ДНК, могли из внешней среды войти в клетку в результате действия осмотических сил. При этом объем клетки увеличивается. Напряженность электрического поля и продолжительность его действия, концентрации трансформирующей ДНК и реципиентных клеток для каждой системы клеток подбирают экспериментально, с тем чтобы достичь высокого процента поглощения ДНК выжившими клетками. Показано, что в оптимальных условиях электропорации количество трансформантов может достигать 80% выживших клеток.

Электропорация — физический, а не биохимический метод, и это, по-видимому, обусловливает его широкое применение. Многочисленные исследования продемонстрировали, что электропорация может успешно использоваться для введения молекул ДНК в разные типы клеток, такие как культивируемые клетки животных, простейшие, дрожжи, бактерии и протопласты растений. Электропорирующий эффект высоковольтного разряда на бислойную липидную мембрану, по-видимому, зависит от радиуса ее кривизны. Поэтому мелкие бактериальные клетки эффективно поглощают ДНК при значительно большей напряженности (10 кВ/см и более), чем крупные животные и растительные клетки, эффективно поглощающие ДНК при напряженности поля 1—2 кВ/см.

Электропорация — наиболее простой, эффективный и воспроизводимый метод введения молекул ДНК в клетки. Однако до недавнего времени этот метод использовался в ограниченном числе лабораторий в связи с отсутствием серийных приборов — электропораторов. Появление и совершенствование таких приборов в ближайшие годы приведет к широкому применению данного подхода в генетической инженерии самых разных типов клеток.
31. Опишите космиды.

Космиды – это плазмидные векторы, в которые встроен участок генома фага лямбда, обеспечивающий возможность упаковки этой молекулы ДНК в фаговую частицу. Необходимыми компонентами космидного клонирующего вектора являются:

- плазмидный участок начала репликации ДНК и детерминанта устойчивости к антибиотику;

- единичное число мест гидролиза одной или несколькими рестриктазами, пригодных для клонирования фрагментов ДНК;

- фрагмент ДНК, содержащий ковалентно зашитые липкие концы фага лямбда (cos-сайт).

Кроме того, космида должна иметь небольшой размер, чтобы можно было клонировать фрагменты ДНК длиной более 30тпн.

Принцип клонирования в космидах предложен был Дж.Коллинзом и Б.Хоном в 1978 году. Лигированию подвергается смесь молекул космидной и клонируемой ДНК, гидролизованных определенной рестриктазой. При этом космида находится в высокой концентрации. Среди большого многообразия проуктов лигазной реакции образуются также молекулы , состоящие из клонируемых фрагментов ДНК, к обоим концам которых пришиты космиды так, что оба cos-сайта находятся в одинаковой ориентации и между этими cos-сайтами сосредоточена вся генетическая информация космиды.

Когда такие молекулы инкубируют в реакции упаковки ДНК фага лямбда in vitro cos-сайты, фланкирующие чужеродную ДНК, расщепляются фаговыми ферментами с образованием одноцепочечных липких концов, и получившиеся молекулы ДНК упаковываются в фаговые карсиды. После инфекции клеток E.coli образовавшимися in vitro фаговыми частицами гибридные ДНК внедряются в клетки, циклизуются по липким фаговым концам, реплицируются как плазмиды и детерминируют устойчивость к определенному антибиотику. В процессе упаковки гибридных ДНК in vitro происходит отбор гибридов, суммарный размер ДНК которых составляет 38-51 тпн. Наиболее популярные космидные векторы имеют размер 4-6 тпн, поэтому в них можно клонировать фрагменты ДНК длиной от 35 до 45 тпн.

Д.Иш-Горовиц и Дж.Бюрк в 1981 г. предложили схему клонирования в космидах. Препарат космидного вектора разделяют на две порции, каждую из которых расщепляют определенной рестриктазой. Первый фермент делает разрыв с одной стороны от последовательности cos, а второй – с другой стороны. Полученные линейные формы космиды дефосфорилируют, что в дальнейшем предотвращает олигомеризацию вектора. После этого оба препарата космиды гидролизуют рестриктазой BamII, смешивают с дефосфорилированными продуктами неполного гидролиза клонируемой ДНК рестриктазами Sau3AI или MboI. При такой процедуре получается лишь один тип молекул ДНК, способных упаковываться в капсиды фага лямбда.

В 1983 году П.Бейтс и Р.Свифт сконструировали новый тип космид, которые позволяют упростить получения космидных библиотек. Такие космиды содержат по два cos-участка, разделенных последовательностью, в которой находится сайт узнавания рестриктазы, образующей при гидролизе ДНК тупые концы. В настоящее время получен широкий спектр разнообразных космид, которые используют при создании библиотек генов прокариотических и эукариотических организмов. Вводя в состав космид полилинкеры, можно существенно расширять возможности этих векторов по клонированию чужеродных фрагментов.



29. Опишите молекулярные векторы E.coli.

В генетической инженерии в качестве клонирующих векторных молекул используют широкий спектр плазмидных и вирусных двухцепочечных ДНК. Однако в ряде случаев, например: при определении последовательности нуклеотидов, выделении комплементарной РНК, направленном мутагенезе и некоторых других, необходимо манипулировать с одной цепью ДНК. При этом приходится разделять цепи ДНК, что не всегда можно сделать достаточно просто. Поэтому клонирование ДНК в одноцепочечных векторах является привлекательным объединением в одном эксперименте процедур изолирования целевой последовательности ДНК, ее размножения (амплификации) и разделения цепей исходно двухцепочечного фрагмента ДНК.


Нитевидные вирусы М13, fd, f1 бактерии Escherichia coli (кишечной палочки), называемые обычно бактериофагами или просто фагами, наиболее подходят для создания одноцепочечных векторных молекул ДНК. Частицы этих фагов представляют собой трубочку (1000 х 6 нм) из гидрофобного фагового белка pVIII, внутри которой содержится молекула кольцевой одноцепочечной ДНК. На одном из концов фаговой частицы молекула ДНК взаимодействует с несколькими молекулами фагового белка pIII, называемого белком-лоцманом. Последовательность нуклеотидов фаговой ДНК расшифрована (6407 нуклеотидов для фага M13, 6408 для фага fd).

Наличие в фаговом геноме области, несущественной для его жизнедеятельности, является важным условием использования этого фага для конструирования гибридных молекул ДНК. У нитевидных фагов существует лишь межгенная область размером 500 нуклеотидов, в которой могут быть произведены изменения (делеции, вставки) без нарушения жизнеспособности фага. Репликативная форма фаговой ДНК не имеет участков узнавания многих рестриктаз, образующих при гидролизе липкие концы, а кроме того, фаговый геном не содержит генетических маркеров, которые позволили бы легко выявлять гибридные фаги. Поэтому конструирование векторных нитевидных фагов включает в себя прежде всего введение в геном селективных маркеров и уникальных участков расщепления определенными рестриктазами.

Первый гибридный фаг M13 был описан Мессингом с соавторами в 1977 году. Репликативная форма ДНК фага M13 гидролизуется рестриктазой BsuRI на 10 фрагментов, имеющих тупые концы. Чтобы получить полный фаговый геном в линейной форме, РФ гидролизовали ограниченным количеством рестриктазы BsuRI так, что каждая молекула ДНК в среднем расщеплялась лишь в одном из участков действия BsuRI. Линейные молекулы размером в полный фаговый геном выделили электрофоретически и к ним добавили HindII-фрагмент лактозного оперона E. coli, имеющий размер 789 пар нуклеотидов (пн) и содержащий часть гена lacI, промоторно-операторную область и начальную часть гена lacZ, кодирующую 145 N-концевых аминокислот β-галактозидазы . Полученные фрагменты сшили по тупым концам с помощью ДНКлигазы фага T4 и провели трансфекцию клеток E. coli.

Созданные фаги получили названия M13mp7, M13mp8, M13mp9 и др. Используя данный набор векторных нитевидных фагов, можно решать большой спектр генноинженерных задач. Кроме векторов на основе фага M13 получены векторы на основе фагов fd и f1.

Расширить возможности использования одноцепочечных векторов удалось путем совмещения генетических элементов плазмид и нитевидных фагов в составе одной молекулы ДНК. Дотто с соавторами в 1981 году по EcoRI-участку плазмиды pBR322 встроили фрагмент репликативной формы ДНК фага f1 размером 1,3 тыс. пн, включающий все элементы генома, необходимые для инициации репликации и морфогенеза фага, и показали, что при суперинфекции фагом f1 клеток E. coli, содержащих созданную плазмиду pD4, примерно половина секретируемых в культуральную среду вирионов несет одноцепочечную ДНК фага f1, а другая половина – одноцепочечную ДНК гибридной плазмиды. В дальнейшем был получен большой набор таких плазмид, которые часто называют фагмидами (phagemid) вследствие возможной двоякости их существования.

Все чаще векторные производные нитевидных фагов используют для экспрессии чужеродных генов в клетках E. coli. На основе использования генно-инженерно реконструированных нитевидных фагов сформулировано и интенсивно развивается новое направление молекулярно-биологических исследований, получившее название фаговый дисплей.



32. Объясните генетическую инженерию культивируемых клеток млекопитающих.

Манипуляции с клетками млекопитающих можно разделить на 2 большие группы: эксперименты с соматическим клетками и эксперименты по трансформации половых клеток. В последнем случае конечный результат – получение трансгенных организмов.



Генетическая транформация соматических клеток млекопитающих.

Культуры трансформированных клеток млекопитающих используют для получения различных веществ. Хотя культуры клеток животных, особенно при массовом выращивании, гораздо менее экономичны, чем бактериальные дрожжевые культуры, они обладают существенным преимуществом - способностью осуществлять мелкие, но весьма важные модификации белков - продуктов гена млекопитающих.

Культуры клеток млекопитающих могут оказаться эффективным источником выделения некоторых вирусных антигенов с целью получения вакцин для животных и человека. Получение таких вакцинных культур клеток осуществимо при помощи техники рекомбинантных ДНК и эффективных векторов экспрессии для клеток млекопитающих и человека. При использовании ДНК-вакцин в организм вводится не антиген, а ген, кодирующий синтез этого антигена. Ген встраивается в плазмиду, а плазмида вводится организм путем обыкновенной инъекции.

Генотерапия. Стандартная схема генокоррекции наследственного дефекта включает серию последовательных этапов. Она начинается созданием полноценно работающей (экспрессирующейся) генетической конструкции, содержащей смысловую (кодирующую белок) и регуляторную части гена. На следующем этапе решается проблема вектора, обеспечивающего эффективную, а по возможности и адресную доставку гена в клетки-мишени. Затем проводится трансфекция (перенос полученной конструкции) в клетки-мишени, оценивается эффективность трансфекции, степень коррегируемости первичного биохимического дефекта в условиях клеточных культур (in vitro) и, что особенно важно, in vivo на животных - биологических моделях. Только после этого можно приступать к программе клинических испытаний.

Существует два типа генотерапии: заместительная и корректирующая. Заместительная генотерапия заключается во вводе в клетку неповрежденного гена. Внесенная копия заменит по функциям сохранившийся в геноме больного дефектный ген. Все проводимые сегодня клинические испытания используют внесение в клетку дополнительных количеств ДНК. При корректирующей терапии предполагается замена дефектного гена нормальным в результате рекомбинации. Пока этот метод на стадии лабораторных испытаний, так как эффективность его еще очень низка, но последние исследования показывают успехи в лечении некоторых заболеваний.



Получение трансгенных животных. В настоящее время животное, чей генотип был изменён введением чужеродной ДНК называют трансгенным, водимую ДНК – трансгеном, а весь процесс – трансгенной технологией или трансгенозом.
Развитие генной инженерии, позволяющей целенаправленно создавать новые
 ДНК – носители генетической информации и встраивать их в геном клетки, которая могла бы дать начало клеткам зародышевой линии, открывает новые перспективы в генетической модификации животных. Метод получения трансгенных животных включает следующие этапы:
1.
 Яйцеклетки получают от самок – доноров, у которых была гормонально индуцирована полиовуляция и проведено искусственное осеменение (или спаривание) с самцами.
2. Трансгенную конструкцию инъецируют в мужской
 пронуклеус оплодотворённой яйцеклетки.
3. Яйцеклетки пересаживают в матку «суррогатной» матери (реципиенту).
4. От них рождается приплод – основатель трансгенной линии.
Благодаря разработке метода введения ДНК в пронуклеус зиготы появилась возможность более эффективного использования животных для повышения их продуктивности и качества продукции, резистентности к болезням и в производстве биомедицинских препаратов.
Впоследствии предложен целый ряд других методов введения чужеродного гена в организм животного.


33. Объясните, как происходит введение ДНК в клетки млекопитающих.

Необходимый этап генно-инженерного эксперимента – введение полученных in vitro гибридных молекул ДНК в пермиссивные клетки (обеспечивающие репликацию этих молекул) с целью размножения, селекции и выделения клонов гибридов.

Введение в клетку нуклеиновой кислоты вируса с последующим образованием вирусного потомства называется трансфекцией. Эффективность трансфекции выражается обычно количеством инфекционных центров (бляшек, негативных колоний), приходящихся на молекулу или единицу массы нуклеиновой кислоты вируса. Вирусные клоны, полученные после трансфекции из отдельных бляшек, называют трансфектантами.

Конъюгация-передача генетического материала у бактерий при прямом межклеточном контакте. Передача фактора F (плазмида размером 60 тыс. п.н.) из одной клетки в другую.

Трансдукция-передача ДНК от клетки донора клетке реципиенту при участии бактериофагов.

Электропорация – наиболее простой, эффективный и воспроизводимый метод введения молекул ДНК в нативной форме в пермиссивные клетки. Импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают

проницаемость мембран. На клетку действуют высоковольтным импульсом (350 В, 54 мс.). Через образующиеся на короткое время поры ДНК проникает в клетку.

Векторы на основе вирусов. С самого начала работ по трансформации животных клеток вирусы были главными кан­дидатами на роль векторов для введения чужеродной ДНК. Вирусная инфекция может быть намного более эффективным способом введения ДНК в некоторые клетки, чем трансфекция. При вирусной инфекции каждая клетка может получить боль­шое число копий чужеродного гена. ДНК можно встраивать так, чтобы она находилась под контролем сильных вирусных промоторов, что обеспечит высокий уровень экспрессии гена, и его продукты будут более доступны для исследования.

В последние годы сконструированы многочисленные «чел­ночные» векторы и их рекомбинантные производные, способные к репликации в животной и бактериальной клетках и эффек­тивно экспрессирующие клонируемый ген в животной клетке. Наиболее распространенные векторы состоят из плазмиды pBR 322 и интактного раннего района транскрипции ДНК SW 40, а нужный ген встраивается под контроль промотора поздних ге­нов или дополнительного раннего промотора.



Микроинъекция ДНК в клетки млекопитающих. С появле­нием   прибора   для   изготовления   микропипеток  диаметром 0,1—0,5 микрона и микроманипулятора появилась возможность введения чужеродной ДНК в культивируемые клетки путем прямой микроинъекции в ядро. Так, плазмиды, содержащие фрагмент вируса герпеса с геном тимидинкиназы и плазмиды pBR 322, были инъецированы в тк-клетки и было показано, что тк-ген проник в ядра и нормально в них реплицировался.

В принципе, при наличии хорошего оборудования можно за 1 ч инъецировать 500—1000 клеток, причем в лучших экспери­ментах в 50% клеток наблюдается стабильная интеграция и экспрессия инъецированных генов. Преимущество описываемо­го метода заключается также в том, что он позволяет вводить любую ДНК в любые клетки, и для сохранения в клетках вве­денного гена не требуется никакого селективного давления.



Упаковка в липосомы (сферические образования,оболочки которых состоят из фосфолипидов). Заключенные в Л. ДНК защищены от нуклеаз, легко проникают к клетки в рез-те слияния липосом и кл. мембраной или при поглощении их фагоцитозом.

Бомбардировка(баллистическая трансформация)

1) ДНК с целевыми генами, адсорбируется на поверхности микрочастиц (0,6-6 мкм) из инертных металлов - золота или вольфрама.

2) Частицам сообщается кинетическая энергия, достаточная для прохождения ч/з кл. стенки.

3) Оказавшись внутри клетки, ДНК с частиц освобождается в цитоплазму и, если оказывается в ядре, встраивается в ядерный геном.



35. Представьте генетическую трансформацию клеток млекопитающих.

Если введенная экзогенная генетическая информация способна сохраняться и экспрессироваться в клетках млекопитающих, то это может приводить к изменению не только генотипа , но и выявляемого фенотипа клеток. Данный процесс называется трансформацией. Возможность генетической трансформации клеток млекопитающих впервые продемонстрировал Л.Краус в 1961 году. Он выделил ДНК из костного мозга человека, гомозиготного по а-полипептиду гемоглобина, и обработал этим препаратом культивируемые клетки костного мозга от пациента с серповидно-клеточной анемией (s). В результате клетки человека приобрели способность продуцировать кроме полипептида s и полипептид а. Однако в данном случае отбор клонов трансформированных клеток был затруднен, т.к. для рассматриваемого признака не найдены условия селекции. Для того чтобы достаточно просто и достоверно идентифицировать клоны трансформированных клеток животных, необходимо использовать гены, кодирующие легко селектируемые признаки. Данная задача была решена прежде всего в экспериментах на линиях клеток, мутатных по генам, ферментные продукты которых участвуют в биосинтезе нуклеотидов. Так, линии, дефектные по гипоксантинфосфорибозилтрансферазе (HPRT), выделены Е. Шибальской и В.Шибальским в 1962 году при выращивании исходной популяции клеток в присутствии 8-азагуанина. Этот аналог гуанина включается в пул пуриновых нуклеотидов под действием HPRT, которая в норме катализирует включение в биосинтетические пути гипоксантина или гуанина. В присутствии азагуанина выживают лишь мутантные клетки, лишенного данного фермента. HPRT не является незаменимым ферментом, поскольку инозинмонофосфат может синтезироваться из низкомолекулярных субстратов – производных фолиевой кислоты.

На ранних этапах наибольшее число иссле­дований по генетической трансформации кле­ток млекопитающих выполнено на клетках ТК~. Использование гена tk в качестве селективного маркера было обусловлено рядом причин:

- Установлено, что вирус простого герпеса со­держит ген тимидинкиназы и инфекция кле­ток ТК~ вирусом герпеса, инактивирован- ным ультрафиолетом, приводит к появле­нию клонов ТК+-трансформантов (1971 г.).

- Геном вируса значительно меньше генома клетки, поэтому относительное содержание гена тимидинкиназы в препарате вирусной ДНК намного больше, чем в клеточной ДНК. Это создало прекрасные предпосылки

для успешной трансформации клеток ТК~ к фенотипу ТК+ как нативными, так и гид- ролизованными с помощью рестриктаз мо­лекулами ДНК вирусов простого герпеса HSV-1 и HSV-2 (1977 г.). При этом биохи­мически и иммунологически подтверждено, что в получаемых ТК+-трансформантах синтезируется вирусспецифичная тимидин- киназа.

- Получены линии клеток, обладающих высо­кой компетентностью для проникновения экзогенных молекул ДНК и дефицитных по тимидинкиназе при низкой частоте спонтан­ной реверсии к фенотипу ТК+. Например, выделена высококомпетентная линия клеток мышиных фибробластов L ТК с уровнем спонтанной реверсии < 10~9 (1977 г.). Анализ клонов ТК+-трансформантов пока­зал, что вводимый вирусный ген ковалентно связывается с хромосомной ДНК клетки. Неза­висимо выделенные клоны трансформантов различались по местам интеграции чужеродной ДНК, следовательно, встройка экзогенной по­следовательности не происходит только по оп­ределенной хромосоме или ее району. Многие исследователи отмечали широкую вариабель­ность получаемых клонов трансформантов по числу копий интегрированного гена tk (от од­ной до нескольких десятков на геном клетки). При этом в каждой клетке (клоне) встройка трансформирующей ДНК происходит в виде множественных тандемных повторов чаще все­го в единственное место на одной из хромосом.

Получаемые клоны ТК+ стабильно сохраня­ют трансформированный фенотип в течение со­тен генераций при росте клеток на селективной НАТ-среде. В неселективных условиях клоны существенно различаются по стабильности со­хранения фенотипа ТК+. По-видимому, боль­шое влияние на стабильность введенного чуже­родного гена оказывает генотип клетки. Так, ТК~-клетки яичника китайского хомяка СНО, трансформированные геном тимидинкиназы вируса HSV-1, стабильно сохраняли фенотип ТК+ при росте в неселективных условиях.



37. Опишите регулируемую экспрессию целевых генов.

В 1989 г. учеными была предложена система регулируемой экспрессии трансгенов в клетках млекопитающих под контролем РНК-полимеразы колифага ТЗ и laс-репрессора. Были созданы плазмиды pUHDll-1 и pUHD12-l, в которых под контроль промоторно-энхансерного района немедленного раннего гена 1 цитомегаловируса человека (hCMV) встроили кодирующие последовательности генов lad E. coli или РНК-полимеразы фага ТЗ соответственно. В третьей плазмиде pUHRll-2 под контроль синтетического сегмента ДНК размером 49 пн, состоящего из последовательностей промотора фага ТЗ и laс-репрессора, поместили кодирующую послед-ть гена luc люциферазы светляка Photinus pyralis. Данные плазмиды не имели селективных маркеров, экспрессируемых в клетках млекопитающих. На первом этапе получили стабильную линию клеток почки кролика RK-T3, продуцирующую РНК-полимеразу фага ТЗ. Для этого линию клеток RK13 кальций-фосфатным методом трансформировали смесью плазмид pUHD12-l и pNEO5, несущей селективный маркер для клеток млекопитающих, и отбирали клоны трансформантов на среде с антибиотиком G-418. Среди устойчивых к G-418 клонов клеток выявляли те, которые продуцировали фаговую РНК-полимеразу. Созданную линию RK-T3 котрансформировали плазмидами pUHDll-1 ирНМ24 (несет ген устойчивости к гигромицину Б) и отбирали клоны на среде с гигромицином. Линия клеток, одновременно продуцирующая фаговую РНК-полимеразу и laс-репрессор, получила название RK-T3i. Микроинъекцией плазмиду pUHRll-2 вводили в клетки линии RK-T3i и анализировали в них продукцию люциферазы без добавления и при добавлении в пит. среду индуктора лактозного оперона ИПТГ. Оказалось, что в отсутствие индуктора уровень активности люциферазы в клетках был очень низким, а добавление ИПТГ приводило к увеличению активности этого фермента в 150 раз. В 1991 г. была предложена более проще система экспрессии: на основе lad. Ученые создали ген химерного трансактиваторного белка LAP267, в котором объединены свойства двух разных белков — laс-репрессора Е. coli и вирионного белка VP16 вируса простого герпеса. В laс-репрессоре первые 59 а/к составляют ДНК-связывающий домен. Второй домен, состоящий из послед-ти а/к 60-320, необходим для связывания индуктора (аллостерической регуляции) и димеризации белка. Третий, С-концевой домен необходим для агрегации димеров и формирования активных тетрамеров. Белок VP16 вируса простого герпеса является трансиндуцирующим фактором α-генов (ранние вирусные гены, транскрибируемые РНК-полимеразой клеток млекопитающих) и содержит активаторный домен в своем С-концевом районе. Кодирующую последовательность этого домена встроили между триплетами, соотв-ми а/кислотным остаткам 267 и 268 laс-репрессора. На N-конце химерный белок LAP267 содержал пептидный сигнал ядерной локализации NLS (nuclear localization signal) большого Т-антигена вируса SV40. Затем были получены варианты гена белка LAP267 с транскрипцией, направляемой с промотора гела 1 цитомегаловируса человека или промотора гена β-актина человека. В полученных стабильных по гену белка LAP267 трансформантах клеток млекопитающих на примере репортерного гена cat, находящегося под контролем мин-го раннего промотора вируса SV40, соединенного с предшествующими ему несколькими копиями laс-оператора, было показано, что созданный трансактиваторный белок LAP267 яв-ся термочувствительным вариантом laс-репрессора. При 39,5°С он не связывается с послед-ми laс-оператора, но добавление небольших концентраций ИПТГ (5 нМ) приводит к восстановлению функции специфического связывания с ДНК. В 1995 г. М. Госсен с соавторами описали более удобную систему ≪обратного≫ тетрациклин-контролируемого трансактиватора rtTA для клеток млекопитающих. Эта система отличается от ранее разработанной тем, что в последовательность белка tetR введены 4 а/к-е замены. Это привело к появлению обратного фенотипа репрессора (rtetR): белку rtTA для связывания с последовательностью tet-оператора и активации транскрипции необходим аналог тетрациклина доксициклин. В отсутствие данного антибиотика rtTA не активирует транскрипцию целевого регулируемого гена.

38. Опишите трансгенные животные.

Разработка системы генетической трансформации культивируемых клеток млекопитающих позволила подойти к решению такого важного вопроса, как введение чужеродных генов в организм животных и получение линий животных, передающих по наследству приобретенные гены — трансгены. Таких животных называют трансгенными животными (ТЖ). Ген вводится в геном хозяина в форме так называемой «генетической конструкции» — послед-ти ДНК, несущей участок, кодирующий белок, и регуляторные элементы (промотор, энхансер и пр.), а также в элементы, обеспечивающие специфическое встраивание в геном (например, т. н. «липкие концы»). Генетическая конструкция может нести несколько генов, часто она представляет собой бактериальную плазмиду или ее фрагмент. В 1974 г. Р. Джениш и Б. Минтц описали первую схему эксперимента по введению чужеродной ДНК в эмбрионы мыши. ДНК вируса SV40 инъецировали в бластоцисты, которые помещали в матку специально подготовленных самок. Из таких эмбрионов развивались нормальные взрослые мыши, часть которых содержала в своем геноме множественные копии ДНК вируса SV40. В дальнейшем были предложены более эффективные приемы создания трансгенных животных: получение клеток тератокарциномы мыши; микроинъекция ооцитов; эмбриональные стволовые клетки; ретровирусы. ТЖ-х получают для целей ксенотрансплантации. Одним из доноров органов яв-ся свиньи, т.к. имеется анатомическое сходство органов и сходство иммунологических св-в. Реакции отторжения при трансплантации имеют сложный механизм. Одним из сигналов для атаки организма на чужой орган являются белки, локализованные на внешней поверхности мембраны. У трансгенных свиней эти белки заменены на человеческие. Еще одно направление трансгеноза – получение устойчивых к болезням животных. Животноводство держится на вакцинах, т.к. селекция ведется преимущественно на хозяйственно ценные признаки – шерстистость, молочность и т. д. К защитным белкам относятся интерфероны, поэтому ген интерферона встраивали различным животным. Трансгенные мыши получили устойчивость, они не болели или болели мало, а вот у свиней такого эффекта не обнаружено. Другое направление – введение генов, кодирующих антисмысловую РНК. Для животноводства острой проблемой являются лейкозы, вызываемые РНК-вирусами. Трансгенные кролики, несущие гены, отвечающие за присутствие в клетке антисмысловой РНК, были устойчивы к лейкозам. ТЖ–х можно использовать для изучения наследственных заболеваний мозга и нервной системы. Гены болезни Альцгеймера (отложение белка β-амилоида приводит к образованию характерных бляшек) и гены, отвечающие за развитие эпилепсии, болезней мозга вводятся в геном нормальных животных; при этом получают трансгенных животных-моделей, на которых можно испытывать различные терапевтические приемы. ТЖ-х стали использовать для исследования воспалительных и иммунологических заболеваний человека, например, ревматоидного артрита. Моделируются болезни, связанные с липидным обменом.


39. Опишите получение трансгенных животных.

Пример: Клетки тератокарциномы мыши. В 1975 г. Б. Минтц с соавторами продемонстрировали возможность введения чужеродных генов в организм животного, используя клетки тератокарциномы (ТСС) мыши, которые способны размножаться в культуре, а также терять свои неопластические св-ва и нормально диф-ся после инъекции в эмбрионы мыши, находящиеся на стадии бластоцисты. Ранние эмбрионы, содержащие инъецированные ТСС, способны развиваться во взрослых мышей, соматические и половые клетки которых мозаичны, т.к. яв-ся смесью ТСС и клеток с генотипом исходного эмбриона. При инъекции в бластоцисты клеток тератокарциномы, несущих чужеродную ДНК использовали перевиваемую линию клеток тератокарциномы и ее ТК-производные, способные после введения в бластоцисту давать начало как соматическим, так и половым клеткам. На ТК-клетках можно осущ-ть генетическую трансформацию, эффективно отбирать клоны трансформантов и инъецировать трансформированные клетки в эмбрионы. В ряде экспериментов продемонстрирована интеграция в геном стволовых клеток тератокарциномы мышей множественных копий гена тимидинкиназы вируса простого герпеса. Котрансформацией с вирусным селективным геном в клетки тератокарциномы вводили ген β-глобина человека. Чужеродные гены стабильно сохранялись в геноме трансформантов в интегрированном состоянии. Более перспективна генетическая трансформация ТСС векторами, содержащими селективные маркеры доминантного типа. В этом случае нет необходимости работать на мутантных линиях клеток, которые могут иметь кроме известной мутации и ряд неидентифицированных изменений в геноме. При помощи вектора pSV2-gpt Б. Минтц в 1982 г. показал возможность такой трансформации ТСС дикого типа. Отобранные трансформанты стабильно сохраняли чужеродную ДНК в интегрированном состоянии. Т.о., в стволовые клетки тератокарциномы мыши котрансформацией с селективным маркером можно ввести любой ген. После отбора и тщательного изучения клонов трансформантов некоторые из них можно использовать для инъекции в ранние эмбрионы в целях получения линий мышей с предопределенными генетическими изменениями. Данная система позволяет анализировать in vivo регуляцию экспрессии различных генов в процессе эмбрионального развития организма.


.

41. Представьте экспрессию генов в трансгенных мышах.

В эксперименте в результате инъекции в ооцит гибридного гена, состоящего из кодирующей послед-ти гена tk вируса герпеса и промоторно-регуляторной области гена металлотионеина 1 мыши, получена трансгенная мышь, в печени и почках которой вирусспецифический фермент продуцировался на высоком уровне. Экспрессия гена МТ-1 металлотионеина контролируется на транскрипционном уровне ионами тяжелых металлов и глюкокортикоидными гормонами. Показано, что гибридный ген, состоящий из регуляторной области МТ-1 и структурной части гена tk, в ооцитах мыши подвержен регуляции ионами кадмия, как и нативный ген МТ-1. После инкубации ооцитов с ионами кадмия выявляемая в них активность тимидинкиназы вируса герпеса увеличивалась примерно в 10 раз. Промоторно-регуляторную область гена МТ-1 использовали для создания эффективно экспрессируемого in vivo гена гормона роста и введения его в геном мыши. Структурную часть хромосомного гена гормона роста крысы подстроили к 5'-концевой регуляторной области гена МТ-1, сконструировав гибридную плазмиду pMGH. Из pMGH выделяли BglU-BamUl-фрагменты, содержащие гибридный ген, и инъецировали их в 170 оплодотворенных ооцитов мыши (600 копий гена на ооцит), которые помещали в репродуктивный тракт самок. В результате развилось 21 животное, и 7 из них были трансгенными. Для достижения высокой продукции гормона роста в корм мышам добавляли ZnSCО4, активирующий транскрипцию гена МТ-1. Результаты показали, что транскрипция гибридного гена MGH инициировалась с промотора гена металлотионеина 1 и продолжалась до участка терминации транскрипции гена гормона роста, 4 интрона правильно сплайсировались и мРНК MGH полиаденилировалась. Некоторые из гигантских мышей были частично стерильны, другие же были способны давать потомство. Один из трансгенных самцов (MGH-10) передал ген гормона роста 10 из 19 потомков, что указывает на стабильную интеграцию гена MGHB одну из ее хромосом. За прошедшие годы накоплено очень много экспериментальных данных по экспрессии экзогенных ДНК в трансгенных мышах. Установлено, что примерно половина всех линий трансгенных мышей не экспрессирует трансген. По-видимому, это связано либо с присутствием в трансгене ингибиторных последовательностей (например некоторых последовательностей прокариотического происхождения), либо с особенностями конкретного сайта интеграции трансгена: экзогенная ДНК может встроиться в транскрипционно неактивные области хромосом. Размер и локализация последовательностей, необходимых для обеспечения правильной экспрессии, зависят от природы гена.



43. Опишите нокаутные мыши.

Направленная инактивация генов яв-ся важным методическим приемом, применяемым для получения трансгенных животных. Наибольшее развитие такие работы получили в экспериментах на мышах. Создание линий мышей, гомозиготных по направленно инактивированному гену, позволяет изучать детерминируемые данным геном свойства на уровне организма. Благодаря появлению методологии получения нокаутных мышей молекулярная генетика этой удобной лабораторной модели стала развиваться. Схема получения нокаутных мышей. Фрагмент целевого гена, который планируют инактивировать in vivo, извлекают из геномной библиотеки мыши на основе фага А, космид и т. п. Внутрь этого фрагмента встраивают доминантный селективный маркер, одновременно часть целевого гена делетируется. В результате получают гибридную плазмиду, в которой к селективному маркеру справа и слева присоединены сегменты целевого мышиного гена (фланкирующие последовательности). Такую конструкцию называют нацеленным вектором (targeting vector). Для повышения эффективности гомологичной рекомбинации фланкирующих последовательностей с хромосомным геном нацеленный вектор обычно расщепляют какой-либо рестриктазой вне фрагмента встройки для перевода его из кольцевой в линейную форму. Полученную линейную ДНК вводят (электропорацией) в культуру эмбриональных стволовых клеток мыши и на селективной среде отбирают клоны трансформантов. С помощью ПЦР и блоттинга по Саузерну выявляются трансформанты, образовавшиеся в результате гомологичной рекомбинаци, приведшей к инсерционно-делеционной инактивации целевого гена. Отбираемые клоны гетерозиготны по мутантному гену, так как инактивирующая встройка происходит в одну из гомологичных хромосом. ES-клетки с направленной мутацией инъецируют в бластоцисты, которые затем помещают в яйцевод псевдобеременных самок. Родившихся химерных мышей скрещивают с мышами исходной линии и получают гетерозиготное потомство по целевому мутантному гену. Этих гетерозигот скрещивают между собой и отбирают в потомстве гомозиготных по мутантному гену мышей. На каждом этапе генотип мутантных мышей определяют с помощью ПЦР и блоттинга по Саузерну, используя образцы геномной ДНК, выделяемой из биоптатов хвоста животных. По описанной схеме X. Такада с соавторами осуществили направленную инактивацию гена SODD у мышей.



44. Обоснуйте биотехнологическое применение трансгенных животных.

1. В 1988 г. впервые удалось получить трансгенных овец, продуцирующих с молоком фактор свертывания крови, необходимый для лечения людей, больных гемофилией. В последующие годы в мире было создано около 20 типов трансгенных коров, коз, свиней, овец и кроликов, которые продуцировали такие ценнейшие фармацевтические вещества, как тканевой активатор плазминогена, различные моноклональные антитела, эритропоэтин, инсулиноподобный фактор роста, интерлейкины, антитрипсин и др. Работы в этом направлении продолжаются, и спектр лекарственных веществ, полученных с помощью трансгенных сельскохозяйственных животных, расширяется. 2. Химозин — ключевой фермент сыроделия, и традиционно его выделяют из слизистой оболочки сычуга забитых молочных телят и ягнят. Очевидно, что эта технология является устаревшей и неэффективной. Поэтому были созданы трансгенные по гену химозина овцы романовской породы, которых скрестили с овцами цыгайской и остфринляндской молочных пород. На всех этапах селекции была отмечена устойчивая экспрессия химозина в молочной железе гибридных самок (300 мг/мл). Полученные препараты использовали для изготовления сыра, качество которого оказалось высоким. 3. Рекомбинантные белки могут быть экспрессированы в разных тканях трансгенных животных, продукция целевых белков в молочной железе с секрецией в молоко остается самым привлекательным способом получения белков, важных прежде всего для медицинских целей. В такой системе рекомбинантные белки легко собирать и очищать. Например, коза в период лактации может произвести до 800 л молока в год при содержании в нем рекомбинантного белка около 5 г/л, т. е. около 4 кг этого белка в год. Т.о., относительно небольшое стадо трасгенных коз может продуцировать в составе молока сотни килограммов рекомбинантного белка в год при его низкой стоимости. Главной проблемой пока остается создание такого стада и его сохранение.


45. Объясните понятие трансгенные растения.

Трансгенными могут называться те виды растений, в которых успешно функционирует ген (или гены) пересаженные из других видов растений или животных. Делается это для того, чтобы растение реципиент получило новые удобные для человека свойства, повышенную устойчивость к вирусам, к гербицидам, к вредителям и болезням растений. Пищевые продукты, полученные из таких генноизмененных культур, могут иметь улучшенные вкусовые качества, лучше выглядеть и дольше храниться. Также часто такие растения дают более богатый и стабильный урожай, чем их природные аналоги.

Последнее десятилетие ученые строят неутешительные прогнозы относительно быстрорастущего потребления сельскохозяйственных продуктов на фоне снижения площади посевных земель. Решение данной проблемы возможно с помощью технологий получения трансгенных растений, направленных на эффективную защиту сельскохозяйственных культур и увеличение урожайности.
Получение трансгенных растений является на данный момент одной из перспективных и наиболее развивающихся направлений агропроизводства. Существуют проблемы, которые не могут быть решены такими традиционными направлениями как селекция, кроме того, что на подобные разработки требуются годы, а иногда и десятилетия. Создание трансгенных растений, обладающих нужными свойствами, требует гораздо меньшего времени и позволяет получать растения с заданными хозяйственно ценными признаками, а также обладающих свойствами, не имеющими аналогов в природе. Примером последнего могут служить полученные методами генной инженерии сорта растений, обладающих повышенной устойчивостью к засухе.

Создание трансгенных растений в настоящее время развиваются по следующим направлениям:

1. Получение сортов с/х культур с более высокой урожайностью

2. Получение с/х культур, дающих несколько урожаев в год.

3. Создание сортов с/х культур, токсичных для некоторых видов вредителей (например, в России ведутся разработки, направленные на получение сортов картофеля, листья которого являются остро токсичными для колорадского жука и его личинок)

4. Создание сортов с/х культур, устойчивых к неблагоприятным климатическим условиям (например, были получены устойчивые к засухе трансгенные растения, имеющие в своем геноме ген скорпиона).

5. Создание сортов растений, способных синтезировать некоторые белки животного происхождения (например, в Китае получен сорт табака синтезирующий лактоферрин человека).

Таким образом, создание трансгенных растений позволяет решить целый комплекс проблем, как агротехнических и продовольственных, так и технологических, фармакологических и т.д. Кроме того, уходят в небытие пестициды и другие виды ядохимикатов, которые нарушали естественный баланс в локальных экосистемах и наносили невосполнимый ущерб окружающей среде.



46. Объясните, как происходит перенос генов в растения из бактерий рода Agrobacterium.

ДНК бактерий существуют не только в виде хромосом, но и в виде маленьких кольцевых молекул (плазмид). Бактерии Agrobacterium tumefaciens помимо прочих содержат плазмиды, вызывающие опухоли (Ti-плазмиды). На такой плазмиде среди прочих генов имеется так называемая область Т-ДНК, содержащая гены, отвечающие за образование опухоли на растениях и синтез опинов. Именно этот кусочек плазмиды агробактерии встраивают в ДНК растений. Выяснилось, что агробактерии в принципе способны переносить в растения любую ДНК, которая расположена в этом месте плазмиды. Поэтому в плазмидах, используемых в генно-инженерных целях, природные гены заменяют любыми другими, представляющими интерес для человека. Как правило, это два-три гена: целевой, который придаёт, например, устойчивость к насекомым; селективный, который придаёт устойчивость к определённым веществам (чаще всего — антибиотикам), что позволяет трансформированной клетке расти в питательной среде с антибиотиками, в то время как нетрансформированные клетки в ней гибнут; и иногда — репортёрный ген, который позволяет качественно определить трансформированную клетку, например, по окрашиванию или свечению в ультрафиолетовом свете. В суспензию агробактерий, содержащих плазмиды с нужными генами, добавляют органы или ткани растений (экспланты), из которых проще всего регенерировать целые растения (чаще всего используются листья). Этот этап называется кокультивацией. Во время кокультивации агробактерии с помощью vir-белков переносят участок Ti-плазмиды и встраивают его в растительную ДНК. Затем растительную ткань помещают на питательную среду, содержащую антибиотики. В этой среде выживают только те клетки, в которые агробактерии перенесли ген, придающий устойчивость к антибиотикам, то есть трансформированные. Условия и состав среды подобраны таким образом, что трансформированные клетки активно размножаются, образуя неорганизованную массу делящихся клеток (калллус), из которой регенерируют трансгенные растения. Полученные растения размножают и подвергают различным анализам сначала в пробирке, а потом — на полях и в теплицах.


47. Обоснуйте использование Ti-плазмиды в создании трансгенных растений.

Некоторые виды агробактерий могут поражать клетки двудольных растений,что приводит к образованию опухоли — корончатого галла, нарушающей нормальный рост растения. Одним из самых сильных индукторов опухолей служит почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens. Способность этой бактерий к образованию опухоли связана с плазмидой, получившей название Ti-плазмида-естественные векторы, обладающие всеми функциями, необходимые для переноса ген.информаций в растениях. Эти плазмиды различаются по типу кодируемых опинов-белков,которые используются бактериями в качестве источников азота и углерода. Плазмиды кодируют 2 типа опинов: либо октопин, либо нопалин. Каждая клетка А. tumefaciens содержит один тип плазмиды:либо октопиновую, либо нопалиновую.Плазмида содержит Т-ДНК, которая составляет 12-22 тыс. пар оснований и встраивается в ДНК растительной хромосомы. Она кодирует ферменты синтеза фитогормонов и опинов - производных аминокислот, которые используются бактерией как источник углерода, азота и энергии. Участок Ti-плазмиды, встречающийся в хромасомах растит-х клеток, называется Т-областью в бактерий и Т-ДНК в клетках растений.Т-область содержит гены, отвечающие за индукцию опухоли, синтез опинов Кроме Т-ДНК в плазмидах имеются область, кодирующая функцию конъюгации (Tra), область репликации (Ori V) и область вирулентности (Vir)..Все гены,ответственные за перенос и интеграцию генов Т-области, находятся не в ней самой, а рядом-в vir-области.



Недостаток этих плазмид состоит в том,что некоторые гены, находящиеся в Т-ДНК,заставляют расти клетки растений независимо от гормонов,вносимых в питательную среду, на которой культивируются данные клетки.И поэтому трудно регенировать норм растение из клеток,содержащих полную пос-ть Т-ДНК. Другой недостаток-большие размеры Ti-плазмиды, из-за которой затруднены какие-либо манипуляций с ней. Интеграция Т-ДНК с хромосомой растений. Процесс трансформации можно разделить на четыре этапа: прикрепление бактерии к стенке растительной клетки, проникновение Т-ДНК внутрь клетки растения, интеграция Т-ДНК в геном растения и экспрессия Т-ДНК.Индукция трансформации может происходить только в месте раневого повреждения р-я, где выделяются углеводы (например, глюкоза и глюкуроновая кислота) и где образуется кислый рН. Весь процесс вырезания и интеграции Т-ДНК в раст-ю хромосому осуществляют продукты генов, локализованных в vir-области. Восприятие раневых сигналов осуществляют белки VirA и ChvE. ChvE, белок, кодируемый хромосомным геном бактерии. Область Т-ДНК окружена одинаковыми повторами длиной 25 пар оснований. Эти последовательности являются сайтами узнавания VirD-эндонуклеазы. Эта эндонуклеаза ответственна за вырезание Т-ДНК. Белки VirB и VirE необходимы для транспорта Т-ДНК из бактерии в растение.В геном растения могут встраиваться несколько копий Т-ДНК. После встраивания в хромосому Т-ДНК становится обычной частью генома растения. Т-ДНК транскрибируется в растительных клетках РНК-полимеразой II растения-хозяина. Сама бактерия в клетку не проникает, а остается в межклеточном пространстве и использует растительные клетки со встроенной Т-ДНК как фабрику, продуцирующую опины - источник азота и углерода.


48. Опишите получение трансгенных растений с использованием бинарной системы.

На первом этапе наибольшее число работ по созданию трансгенных растений было выполнено на табаке Nicotiana tabacum. Это связано как с простотой манипуляций в культуре табака при проведении генетической трансформации, так и с высокой эффективностью регенерации трансформированных растений на селективных средах. Для экспериментов по трансформации Nicotiana tabacum, а также других пасленовых особенно удобны листовые диски, полученные от растений, размножаемых in vitro или в теплицах. При культивировании на соответствующих средах в области срезов листовых дисков быстро формируется каллус. На среде для регенерации побегов вблизи срезанных краев фрагментов листа через некоторое время появляются побеги вместе с сопутствующим каллусом. Листовые пластинки табака не содержат покоящихся почек или преформированных зачатков органов, и, следовательно, большинство побегов, формирующихся у края среза, происходит из дедифференцированных клеток. Данные клетки высокочувствительны к трансформации A. tumefaciens. Побеги, вырастающие на селективной среде после инкубации листовых дисков с культурой векторных агробактерий, дают начало растениям, ДНК которых затем проверяют в ПЦР на наличие встройки целевого и селективного генов, используя специфичные для каждого гена пары олигонуклеотидных праймеров. В отличие от табака для других видов растений, даже пасленовых — картофеля и томатов, сложно подобрать условия регенерации из каллуса на селективных средах после агробактериальной трансформации. Поэтому используют другие, более трудоемкие процедуры. Например, для получения трансформантов томатов иногда применяют так называемый метод «фламинго». В этом случае полученные из семян проростки томатов размером 3-4 см с четко выраженными семядолями отбирают для агробактериальной трансформации. Стерильной бритвой делают косой срез, отсекающий через точку роста одну из семядолей. В итоге образуется достаточно обширная раневая поверхность, на которую наносят культуру A. tumefaciens, содержащую бинарный вектор с хелперной плазмидой Ti, и выдерживают определенное время. Инфицированные экспланты помещают на агаризованную питательную среду, содержащую канамицин и антибиотик, убивающий агробактерии. На раневой поверхности обр-ся регенеранты, которые через 2-3 нед. отделяют от родительского растения и переносят на среду для укоренения. Укоренившиеся на селективной среде растения подвергают анализу на наличие целевых встроек в хромосомной ДНК. Выход трансгенных растений при исп-нии данного метода невелик, поэтому приходится инфицировать большое кол-во эксплантов и тщательно анализировать регенерировавшие растения. Чтобы избежать возможной мозаичности получаемых регенерантов по встройке целевого гена, необходимо выращивать их до получения семян. Семена проращивают на селективной среде; выросшие растения анализируют на наличие встройки целевого гена и оценивают уровень его экспрессии по продукции специфичных мРНК и белка. Многие однодольные растения, в частности кукуруза, рис, ячмень и пшеница, при инфицировании разными вирулентными штаммами Agrobacterium не поддерживают рост корончатых галлов, но могут быть генетически трансформированы при агробактериальном переносе генов устойчивости к антибиотикам или гербицидам. По мере адаптации разработанных методов круг видов растений, вовлекаемых в генно-инженерные эксперименты с использованием агробактериальной системы трансформации, постоянно расширяется.

49. Опишите, как происходит экспрессия и наследование чужеродных генов, введенных в растения в составе тДНК.

В экспериментах по экспрессии трансгенов в растениях первоначально исп-ли хорошо охарактеризованные конститутивные промоторы ДНК-содержащего вируса мозаики цветной капусты, обеспечивающие транскрипцию молекул 35S и 19S РНК, или промоторы опиновых синтетаз. С развитием иссл-ний стали исп-ть также регулируемые тканеспецифичные промоторы, н-р, клубне-специфичный промотор гена пататина картофеля или промотор гена Е8, индуцируемый при созревании плодов томатов. Агробактериальная трансформация растений приводит к интеграции Т-ДНК или гибридов на ее основе в различные участки разных хромосом. Каждое трансгенное растение индивидуально по месту встройки и числу встроенных копий Т-ДНК. Некоторые особи могут содержать единичную встройку гибридной Т-ДНК, в то время как другие — низкокопийные тандемные повторы Т-ДНК. Уровень экспрессии трансгена может значительно варьировать у разных трансгенных растений, полученных в одном эксперименте, при этом он часто не коррелирует с копийностью, а зависит от положения трансгена в растительном геноме (близость или удаленность от сильных промоторов, усилителей или глушителей транскрипции и т. п.).

При изучении трансгенных растений обнаружили эффект сайленсинга трансгена в последующих поколениях, т. е. у ряда индивидуальных трансгенных растений может происходить снижение уровня или полное прекращение синтеза целевого белка, кодируемого встроенным трансгеном. Механизмы замолкания гена могут быть разными. Н-р, встройка двойной копии трансгена в ориентации «голова к голове» (ин- вертированный повтор) приведет к нестабильности конструкции и выщеплению трансгена. Это рекомбинационный сайленсинг. Метилирование промотора трансгена, обусловленное встройкой Т-ДНК в активно метилируемые районы генома растения, приведет к транскрип- ционному сайленсингу. Специфичное расщепление мРНК, в которое вовлекаются низкомолекулярные двухцепочечные молекулы РНК, вызывает посттранскрипционный сайлесинг трансгена. Такой механизм наиболее часто встречается у трансгенных растений, полученных прямым переносом ДНК, так как в этом случае интегрируется большое число трансгенов и образуются множественные повторы. Учитывая возможность замолкания трансгена, в каждом эксперименте необходимо получать как можно больше трансгенных растений и тестировать уровень экспрессии встроенного гена. При этом по сравнению с исходными трансформантами (поколение ТО) более надежные результаты будут получены при анализе растений следующих поколений (TI или Т2), выросших на селективной среде из семян.
50. Опишите прямой метод введения трансгена в растения.

На первых этапах развития генетической инженерии растений возникали большие сложности в осуществлении агробактериальной трансформации различных видов растений, и в первую очередь однодольных. Поэтому были предприняты попытки найти более универсальный метод введения молекул ДНК в клетки растений. В 1987 г. Дж. Сэнфорд с соавторами разработали метод бомбардирования микрочастицами и опробовали его на тканях лука. В качестве мишени был использован монослой больших эпидермальных клеток. Затем этот методический прием был успешно реализован на многих видах растений, а также на бактериях, грибах и даже животных. Современные варианты приборов для бомбардирования микрочастицами называют обычно генными пушками. Для бомбардирования наиболее удобны химически инертные частицы золота диаметром 0,6-3 мкм, на которые адсорбируют молекулы ДНК. Этими частицами заряжают генную пушку, и после выстрела частицы пробивают клеточные стенки, ДНК попадает внутрь клетки и в конечном итоге — в ядро (или пластиды). Для многих исследований можно использовать более дешевый «носитель» ДНК — вольфрамовые микрочастицы, однако иногда они проявляют фитотоксичность. Вводимые методом бомбардирования плазмиды обычно содержат гены, необходимые для размножения и селекции гибридных плазмид в бактериальных клетках, а также селективный и целевой гены, находящиеся под контролем промоторов и терминаторов транскрипции, функционирующих в растениях. В качестве селективного для трансформированных растений гена чаще всего используют ген устойчивости к канамицину. Уже через час после бомбардирования в тканях растения может быть выявлена экспрессия вводимого трансгена, однако стабильная интеграция плазмидной ДНК наблюдается лишь в небольшой доле клеток, в которые она была введена. Это указывает на то, что большая часть плазмид в клетке деградируется. В клетке плазмидные ДНК рекомбинируют между собой и хромосомной ДНК. В результате плазмида может интегрироваться в хромосомную ДНК растения в индивидуальном или, чаще, в мультимерном виде. Встройка в хромосомную ДНК растений происходит случайным образом, как и в клетках млекопитающих. Метод бомбардирования позволяет осуществлять котрансформацию растений разными плазмидами, при этом плазмиды обычно встраиваются в геном растения как коинтегранты. На основании полученных результатов можно полагать, что механизм интеграции чужеродной ДНК в хромосомы клетки при прямом переносе плазмид, не содержащих протяженных областей гомологии с хромосомной ДНК, схож у растений, животных и дрожжей. В отличие от агробактериальной системы трансформации растений, обеспечивающей достаточно надежное сохранение встраиваемых генов, прямой перенос приводит к значительно большему разнообразию вариантов встроенных структур, так как они чаще подвергаются рекомбинациям и перестройкам. Поэтому при прямом введении трансгенов в клетки растений необходимо особенно тщательно осуществлять анализ встроек, используя большее число трансформантов. Это увеличивает трудоемкость экспериментов.



51. Опишите, как происходит синтез в растениях чужеродных белков медицинского назначения.

Для медицинских целей растения используют тысячи лет, но генетическая инженерия позволила создать новые растения, белковые продукты которых важны для терапии различных заболеваний. Гены терапевтически важных белков человека и животных можно вводить в разные системы экспрессии, каждая из которых имеет свои достоинства и недостатки. Идеальной является система экспрессии, которая наиболее безопасна и обеспечивает продукцию биологически активного продукта по минимальной цене. В системе клеток млекопитающих могут синтезироваться белки человека и животных, в максимальной степени схожие с природными, но культивирование таких клеток дорого и ограничено по масштабу. Бактерии можно производить в большом масштабе, но синтезируемые в них эукариотические белки далеко не всегда имеют правильную третичную структуру. Кроме того, они не могут подвергаться посттрансляционной модификации. Продукция рекомбинантных белков в растениях имеет ряд потенциальных преимуществ перед другими системами экспрессии чужеродных генов. Растительные системы более дешевы по сравнению с культивированием в биореакторах. Все, что требуется для нормальной жизнедеятельности растений, — это минеральные соединения, содержащиеся в почве, вода, энергия солнечного света и углекислый газ. В растениях возможна посттрансляционная модификация синтезируемых чужеродных полипептидов. Обязательным условием образования функционально активных белков является правильная укладка полипептидной цепи. У млекопитающих за это отвечают по крайней мере два шаперона — BiP/GRP78 и GRP94. В высших растениях сигнальные последовательности (на-пример Lys-Arg-Glu-Leu на С-конце полипептида) направляют белки в эндоплазматический ретикулум, где обнаружены шапероны, гомологичные BiP/GRP78 и GRP94. Важной особенностью растений по сравнению с культурами клеток млекопитающих и трансгенными животными является то, что в них не могут развиваться такие патогены человека и животных, как вирусы, прионы и др., что обеспечивает гораздо большую безопасность генно-инженерных продуктов, выделенных из растений. Технологии сбора и обработки растений в больших масштабах уже существуют, что значительно упрощает и удешевляет работу с посевами трансгенных растений. Белки, продуцируемые в семенах, клубнях, плодах, обладают значительной стабильностью и могут сохраняться в них без выделения длительное время. Значительную долю в стоимость рекомбинантных белков медицинского назначения вносит их очистка. При синтезе некоторых белков в зерне риса, пшеницы, плодах томата, бананов и др. возможно их введение в организм алиментарным путем (с пищей) без предварительной очистки, что значительно снизит стоимость таких препаратов.


60. Опишите методы анализа ГМО.

Все методы идентификации ГМИ растительного происхождения подразделяют на 3 группы: химические, иммунологические, метод ПЦР.



Химические методы. Направлены на определение соединений, которые могут синтезироваться в клетках ГМО в ответ на внедрение чужеродных генов: трансгенная ДНК, новый экспрессированный белок, ферменты, олигосахариды, высокомолекулярные жирные кислоты, витамины, гормоны и др. Эти методы могут использоваться, например, при идентификации некоторых линий генетически модифицированной сои, у которых установлены изменения в жирнокислотном составе липидов.

Иммуноферментные (иммунологические) методы. Основаны на использовании специфических антител для связывания модифицированного белка и последующего их количественного определения. ELISA-тест заключается в обнаружении специфических белков, экспрессирующихся в трансгенных растениях. Одним из недостатков этого метода является низкая эффективность при оценке продуктов, подвергшихся какой-либо технологической обработке, вызывающей практически полную денатурацию молекул ДНК, а также необходимость учитывать тот факт, что во многих случаях уровень экспрессии белка в разных частях растений различен и часто в органах, используемых в пищу, уровень экспрессии может быть очень низким.

Метод полимеразной цепной реакции (PCR или ПЦР). Основан на обнаружении трансгенной ДНК. Метод ПЦР заключается в выявлении рекомбинантной ДНК при использовании для создания трансгенных растений «кассет экспрессии». В случае применения другой генетической конструкции данный метод неадекватен. Метод ПЦР, имеющий несколько модификаций, является в настоящее время наиболее распространенным, т.к. модифицированная ДНК синтезируется во всех частях ГМО. Однако и в данном случае ДНК трудно определить в продуктах прошедших обработку в условиях высоких температур или агрессивных химических соединений, но перечень продуктов, ограничивающих возможности этого метода, невелик: белковые гидролизаты, модифицированные крахмалы, сахар, этиловый спирт, рафинированные масла. Объединенный Научный Центр Европейской Комиссии объявил этот метод в качестве стандартного метода (полимеразная цепная реакция); он используется в таких странах как Германия, Италия, Испания, Ирландия, Португалия, Швейцария, Норвегия, Австрия, Бельгия, Канада, Дания, Финляндия, Япония, Южная Корея, Швеция, Великобритания.

52. Объясните, что такое съедобные вакцины.

Вакцины – иммунобиологические препараты для создания искусственного активного специфического иммунитета с целью профилактики инфекционных заболеваний.



Съедобная вакцина— вакцина, созданная на основе трансгенного растения, продуцирующего протективные антигенные белки инфекционных агентов, и вводимая в организм через поедание этого растения в виде пищевого продукта. Стенки клеток растений обеспечивают эффективную защиту находящегося в них антигена в ротовой полости и в желудке, содержимое которого имеет кислую реакцию. Поэтому «упакованный» таким образом антиген эффективно достигает кишечника, где индуцирует иммунный ответ на уровне слизистых оболочек. Важной особенностью съедобных вакцин является их потенциальная дешевизна, биологическая безопасность (отсутствие в растениях патогенов человека и животных), простота хранения и применения. В будущем можно будет создать растения, продуцирующие одновременно несколько протективных антигенов различных патогенов. Это будут мультивалентные съедобные вакцины. Концепцию производства вакцин в трансгенных растениях впервые сформулировали X. Мэйсон с соавторами (1992 г.). Они предприняли попытку получения съедобной вакцины против вируса гепатита В на основе трансгенного табака. Были созданы растения, экспрессирующие поверхностный антиген вируса гепатита В. Рекомбинантный HBsAg выделили из трансгенных растений с помощью иммуноаффинной хроматографии и исследовали под электронным микроскопом. Оказалось, что рекомбинантный HBsAg способен собираться в вирусоподобные частицы размером около 22 нм и взаимодействовать с антителами, выделенными из крови лиц, инфицированных HBV. Вакцинация мышей инъекционным способом HBsAg антигеном, выделенным из трансгенных растений т бака, стимулировала такой же специфичный иммунный ответ, как и коммерческая дрожжевая субъединичная вакцина. Это исследование показало возможность создания трансгенных растений для получения рекомбинантных вирусных белков, обладающих нормальной биологической активностью. На следующем этапе был создан трансгенный картофель, продуцирующий HBsAg, и при скармливании мышам клубней такого картофеля наблюдали развитие специфичного иммунного ответа против вируса гепатита В. В 1999 г. были начаты эксперименты на добровольцах, и у людей, поедавших сырые клубни картофеля, также наблюдали специфичный противовирусный иммунный ответ. Другая группа исследователей в 1999 г. создала съедобную вакцину против вируса гепатита В на основе люпина и салата. У мышей, которым скармливали люпин, наблюдалось появление антител к вирусу, а у добровольцев, получавших с пищей трансгенный салат, развивался специфический иммунный ответ на вирусный белок. X. Мэйсон с соавторами создали в 1996 г. трансгенные растения картофеля и табака, экспрессирующие белок нуклеокапсида вируса Норфолка, вызывающего у людей острый гастроэнтерит. Было показано, что чужеродный белок в растении формирует вирусоподобные частицы диаметром 38 нм, идентичные частицам, полученным в культуре клеток насекомых, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом. При скармливании клубней трансгенного картофеля мышам у них стимулировалось образование специфического IgG, а при внутрижелудочном введении листьев трансгенного табака наблюдалось появление сывороточного IgG и секреторного IgA, специфичных к вирусоподобным частицам.

Работы по созданию съедобных вакцин активно продолжаются. Важным направлением развития данных исследований является создание съедобных вакцин на основе растений, которые могут широко использоваться в пищу без термообработки (томаты, бананы, са- лат и др.). По принятой в настоящее время концепции для увеличения эффективности съедобных вакцин необходимо решить проблему повышения уровня продукции целевых антигенов в трансгенных растениях, так как классический подход обеспечивает довольно низкую продуктивность. Большие надежды на решение этой проблемы связывают с разрабатываемыми системами экспрессии на основе вирусов растений и генетической трансформации хлоропластов.



53. Объясните, как осуществляется перенос генов в растения с помощью вирусов.

Высокий уровень экспрессии встроенного гена, быстрая аккумуляция значительных количеств чужеродного белка и вследствие этого простота его очистки делают вирусы растений привлекательными векторами для переноса генов. Вирусы р-й имеют более широкий круг хозяев, чем агробактерии. Если антиген многократно экспонирован на поверхности вирусных ч-ц, его иммуногенность существенно повышается. В кач.носителей исп.белки оболочки вирусов табачной мозаики, мозаики коровьего гороха, мозаики вигны китайской, мозаики люцерны или Х-вирус картофеля, геномы которых имеют небольшие размеры и содержат плюс цепь РНК. Например, геном Х-вируса картофеля (ХВК) содержит 5 генов: ген РНК-зависимой РНК-полимеразы, три гена, составляющих так называемый тройной блок генов, функции которых связаны с межклеточным транспортом вируса, а также ген белка оболочки. При попадании вирусной РНК в клетку растения происходит ее трансляция и синтез продукта первого гена - РНК-полимеразы. Остальные гены при этом не экспрессируются, поскольку эукариотические РНК являются функционально моноцистронными, т.е. транслируется только ближайший к 5'-концу РНК ген. Экспрессия остальных генов является результатом синтеза РНК-полимеразой набора более коротких «субгеномных» РНК, соответствующих этим генам. При конструировании вирусного вектора можно заменить один из вирусных генов целевым геном или вставить целевой ген в качестве «дополнительного» гена под контролем дополнительного промотора «субгеномной» РНК. Векторы на основе геномов фитовирусов успешно применяются для продукции в растениях белков медицинского назначения, в том числе вакцинных белков возбудителей бешенства, чумы, антител и многих других.

Повышение эффективности вирусных систем экспрессии возможно несколькими способами. Во-первых, в результате подавления антивирусных защитных реакций растения, приводящие к специфической деградации вирусной РНК (посттранскрипционный ген-сайленсинг). Во-вторых, за счет стабилизации рекомбинантной вирусной РНК, достигаемой, например, введением в нее интронов и удалением потенциальных сайтов сплайсинга. Также оптимизируются методы введения рекомбинантного вирусного генома в растительные клетки. Уровень экспрессии генов может регулироваться и на стадии трансляции этой мРНК.

Существуют ограничения по размеру вставки. Кроме того, вирусная система не обеспечивает наследования растениями экзогенной РНК: продукция вируса и экспрессия встроенного целевого гена возможна только в инфицированных растениях в ограниченных промежуток времени. Главными недостатками вирусной системы экспрессии в р-х явл.опасность р-нения этих вирусов в окр.среде насекомыми, мех-ми и др.способами.


58. Обоснуйте использование трансгенных растений в сельском хозяйстве.

- Борьба с вредителями сельскохозяйственных культур. Потери урожая от насекомых-вредителей могут быть огромны, и как результат это приводит к разрушительным финансовым потерям для фермеров и голоду в развивающихся странах. Фермеры обычно используют тонны пестицидов ежегодно. Потребители не хотят, есть пищу, которая была обработана пестицидами из-за потенциальной опасности для здоровья, а стоки сельскохозяйственных отходов от чрезмерного использования пестицидов и удобрений могут отравить воду и причинить вред окружающей среде.

Выращивание ГМО продуктов, таких как кукуруза Bt. может помочь устранить применение химических пестицидов и уменьшить стоимость урожая.

- Устойчивость к гербицидам. Для некоторых культур удаление сорняков с помощью физических средств, таких как прополка, не рентабельно, поэтому фермеры часто распыляют большое количество различных гербицидов, чтобы уничтожить сорняки. Это долговременный и дорогостоящий процесс, т. к. он требует осторожности, чтобы гербициды не вредили выращиваемым сельскохозяйственным культурам или окружающей среде.

Создание с/х культур с помощью ГИ, устойчивых к одному очень мощному гербициду может помочь предотвратить нанесение ущерба окружающей среде за счет сокращения количества необходимых гербицидов. Фермеру, выращивающему трансгенные соевые бобы, теперь требуется только одна обработка гербицидом вместо нескольких, что ведет к снижению производственных затрат и количества опасных с/х отходов.

- Устойчивость к болезням. Есть много вирусов, грибков и бактерий, которые вызывают болезни растений. Ученые биологи работают над созданием растений с устойчивостью к этим болезням, внедренной ГИ.

- Устойчивость к холоду. Неожиданный мороз может уничтожить чувствительные саженцы. Ген-антифриз от холода, извлеченный из рыбы, был внедрен в растения, такие, как табак и картофель. С помощью гена-антифриза, эти растения способны переносить низкие температуры, которые обычно убивают неизмененные саженцы.

- Засухоустойчивость и устойчивость к соли. По мере того, как население мира растет, и все больше земли используется для жилья, а не для производства продуктов питания, фермеры вынуждены выращивать сельскохозяйственные культуры в местах, ранее не подходящих для выращивания растений.

Создание растений, которые могут выдержать длительные периоды засухи или высокое содержание соли в почве и подземных водах поможет людям в выращивании зерновых культур в ранее «негостеприимных» местах.

55. Объясните трансгенную систему хлоропластов.

Пластиды нах-ся в большом кол.в разных ор.и тк.р-й. Геном пластид – пластома – кольцевая мол.двухцепочечной ДНК размером 120-180 тпн. Пластиды полиплоидны и каждая несет от 10 до 100 пластом.

Транспластомные растения – растения, сод.трансгенные пластомы. Для введения экзогенной ДНК в пластиды листья растения обстреливают микрочастицами вольфрама, на поверхности к-х была адсорбирована ДНК гибридной плазмиды. Данная плазмида была получена встройкой в клонирующий вектор E.coli фрагмента пластидной ДНК мутантной линии этого растения, высокоустойчивого к антибиотикам.

Векторы пластидной трансформации представляют собой гибридные плазмиды E.coli, содержащие селективный и целевой для р-ий гены, фланкированные сегментами пластомной ДНК. (Фланкирующие области, посл-ти – области (нуклеотидные посл-ти) ДНК, располагающиеся по обе стороны от специфического локуса, гена или к.-н. иной нукл-й посл-ти; разл.5'- и 3'-Ф.о) Фланкирующие посл-ти не обл.к.-л. специфическими св-вами, они им.размер 1-2 тпн и гомологичны выбранному району пластомы. Обычно встройку чужеродных генов осуществляют в межгенные участки ДНК пластид. Важным отличием транспластомных растений от классических трансгенных явл.то, что пластидной трансформацией получают клоны со встройкой трансгена в одно и то же место пластидной ДНК. При экспрессии трансгена чаще всего исп.сильный пластидный промотор гена rrn6. Транскрибируемая трансгенная РНК для эффективной трансляции на рибосомах пластид должна содержать на 5'-конце соответствующий участок связывания рибосом. Наряду с RBS некоторых пластидных генов хорошо себя зарекомендовала аналогичная последовательность гена 10 фага Т7. Некодирующий 3'-концевой район гена psbА компонента реакционного центра фотосистемы II хлоропластов стабилизирует транскрипты чужеродных генов, поэтому его обычно помещают в 3'-концевую часть трасгена, создаваемого для встройки в пластиды. Транспластомные растения табака могут обеспечить продукцию целевого чужеродного белка на уровне 1-25 % суммарного растворимого белка растения. Важной особенностью пластид является возможность экспрессии в них оперонов и трансляции белков с полицистронных мРНК, что характерно для прокариот, но не реализуется у эукариот (в том числе в ядре клеток растений). Также важно, что пластиды передаются по материнской линии и обычно не содержатся в пыльце. Поэтому транспластомные растения по сравнению с обычными трансгенными растениями более безопасны для окружающей среды, так как в них предотвращается неконтролируемое распространение трансгена в другие растения. Поскольку интеграция в пластому происходит в результате гомологичной рекомбинации, отобранные клоны одинаковы и в них отсутствует эффект положения гена, характерный для случайной встройки трансгена при ядерной трансформации растений. В пластидах не наблюдается сайленсинг трансгена, поэтому его экспрессия стабильно сохраняется

в последующих поколениях.
56. Представьте белковый сплайсинг в трансгенных растениях.

Было показано, что некоторые прокариотические и эукариотические гены содержат вставки в кодирующей последовательности в правильной рамке трансляции, которые выщепляются из белка, а не РНК. Данный процесс назвали белковым сплайсингом. Было обнаружено, что исходно синтезируется единый белок-предшественник, из которого затем выщепляется внутренняя последовательность, а фланкирующие последовательности ковалентно воссоединяются.

Такие вставки в белке-предшественнике называются интеинами, а воссоединяющиеся фланкирующие части белка — экстеинами. Уже выявлено более 100 интеинов, и

наряду с классическим сплайсингом белка обнаружены примеры белкового транс-сплай-



синга. Напр., в цианобактерии белок, являющийся каталитической α-субъединицей ДНК полимеразы III кодируется расщепленным геном dnaE, одна часть которого отделена от другой протяженным сегментом ДНК. Фрагменты интеина этих полипептидов объединяются, обусловливая белковый транс-сплайсинг, в процессе которого выщепляется интеин и сшиваются экстеины, образуя зрелую каталитически активную α-субъединицу ДНК-полимеразы III. Интеин в данном случае называют расщепленным (split intein). Оказалось, что расщепленный интеин белка DnaE можно использовать in vivo для направленного процессинга других полипептидов, объединенных с последовательностями 1n и 1с. Это свойство расщепленного интеина было использовано для реконструирования в трансгенных растениях функционально активных белков из раздельно синтезируемых фрагментов. На первом этапе сконструировали гибридную плазмиду интеграции в пластидный геном p226ag, в которой разнонаправленно с промоторов гена psbA транскрибировались последовательности химерных белков aadA-In и Ic-smGFP. Поскольку промотор гена psbA функционально активен и в клетках Е. coli, в этих бактериях проверили возможность транс-сплайсинга химерных белков. Вестерн-блот анализом было показано образование в трансформированных клетках Е. coli белка размером 57 кДа, взаимодействующего с моноклональными антителами как против aadA, так и против smGFP. Для проверки возможности белкового транс-сплайсинга в пластидах хлоропласты табака трансформировали плазмидой p226ag. В полученных транспластомных растениях был обнаружен эффективный синтез чужеродных белков и образование химерного белка с одновременным выщеплением фрагментов интеина.Дальнейшие исследования показали, что транс-сплайсинг белковых фрагментов может происходить в растениях и в том случае, когда ген одного из фрагментов находится в хлоропластах, а другого — в ядре. Этот факт открыл возможность осуществления комбинаторной белковой инженерии in vivo в трансгенных растениях.

57. Обоснуйте перспективы использования трансгенных растений с новыми биотехнологическими свойствами.

Среди основных плюсов ГМО стоит выделить следующие:

- Борьба с вредителями сельскохозяйственных культур. Выращивание ГМО продуктов таких, как Bt.-кукуруза может помочь устранить применение химических пестицидов и уменьшить стоимость урожая.

- Устойчивость к гербицидам.

-Устойчивость к болезням.

- Устойчивость к холоду.

- Засухоустойчивость и устойчивость к соли.

- Качество питания. Плохое питание является общей тенденцией в странах третьего мира, где обнищавшие народы полагаются на одну сельскохозяйственную культуру, например, рис, как на основной продукт питания. Однако рис не содержит достаточного количества всех необходимых питательных веществ. ГМ рис может содержать дополнительные витамины и минералы, и за счет этого недостаток питательных веществ может быть скомпенсирован.

Например, слепота из-за дефицита витамина А является распространенной проблемой в странах третьего мира. Ученые создали линию «золотого» риса, который содержит необычайно высокое количество бета-каротина (витамина А).

- Фармацевтика. Лекарственные средства и вакцины часто являются дорогостоящими для производства, а иногда и требуют особых условий хранения, и не доступны в странах третьего мира. Исследователи работают над созданием съедобных вакцин в помидорах и картофеле. Эти вакцины будет гораздо легче транспортировать и хранить, чем традиционные инъекционные вакцины. Также возможно выращивание человеческих белков в растениях, что дешевле, чем выращивание трансгенных животных.

- Фиторемедиация. Не все ГМО растения выращиваются в качестве с/х культур. Загрязнение почв и грунтовых вод по-прежнему является проблемой во всех частях мира.

Модифицированную конструкцию бактериального гена, кодирующего белок, который переносит и детоксицирует ртуть, использовали для трансформации табака, рапса, тополя. Растения, такие как тополь, были модифицированы с помощью ГИ для очистки загрязненной тяжелыми металлами почвы.

В общем же можно выделить следующие риски производства ГМП:

- Опасность объединения видового состава и сортамента с/х культур.

- Термальные технологии. При посеве семян с признаками «термальности» удается получить лишь одно поколение растений, дающих хозяйственно полноценный товарный урожай; семена (плоды) последних оказываются либо невсхожими, либо погибают сразу после всходов.

- Вертикальный перенос генов реализуется посредством перекрестного опыления и половой гибридизации трансгенных растений и их сородичей.

- Гориз.перенос генов. Встраивание трансгена может приводить к нежелательным воздействиям на геном организма. Встраивание трансгена также может нарушить первичную структуру какого-либо хозяйственного гена и, тем самым вызвать его инактивацию. Впоследствии это может привести к мутации.

- Проблемы безопасности селективных и маркерных генов.



59. Опишите геномодифицированные продукты.

Генети́чески модифици́рованный органи́зм (ГМО) — организм, генотип которого был искусственно изменён при помощи методов генной инженерии. Это определение может применяться для растений, животных и микроорганизмов. Генетические изменения, как правило, производятся в научных или хозяйственных целях. Генетическая модификация отличается целенаправленным изменением генотипа организма в отличие от случайного, характерного для естественного и искусственного мутационного процесса. Основным видом генетической модификации в настоящее время является использование трансгенов для создания трансгенных организмов. В сельском хозяйстве и пищевой промышленности под ГМО подразумеваются только организмы, модифицированные внесением в их геном одного или нескольких трансгенов. В настоящее время специалистами получены научные данные об отсутствии повышенной опасности продуктов из генетически модифицированных организмов по сравнению с традиционными продуктами. Продовольственная и сельскохозяйственная организация ООН (FAO) рассматривает использование методов генетической инженерии для создания трансгенных сортов растений либо других организмов как неотъемлемую часть сельскохозяйственной биотехнологии. Прямой перенос генов, отвечающих за полезные признаки, является естественным развитием работ по селекции животных и растений, расширивших возможности селекционеров в части управляемости процесса создания новых сортов и расширения его возможностей, в частности, передачи полезных признаков между нескрещивающимися видами. Есть мнение, что при нынешней численности населения планеты только ГМО могут избавить мир от угрозы голода, так как при помощи генной модификации можно увеличивать урожайность и качество пищи.

Основные этапы создания ГМО:

1. Получение изолированного гена.

2. Введение гена в вектор для переноса в организм.

3. Перенос вектора с геном в модифицируемый организм.

4. Преобразование клеток организма.

5. Отбор генетически модифицированных организмов и устранение тех, которые не были успешно модифицированы.

Процесс синтеза генов в настоящее время разработан очень хорошо и даже в значительной степени автоматизирован. Существуют специальные аппараты, снабжённые ЭВМ, в памяти которых закладывают программы синтеза различных нуклеотидных последовательностей. Такой аппарат синтезирует отрезки ДНК длиной до 100—120 олигонуклеотидов.

Применение: В настоящее время генетически модифицированные организмы широко используются в фундаментальных и прикладных научных исследованиях. С помощью ГМО исследуются закономерности развития некоторых заболеваний (болезнь Альцгеймера, рак), процессы старения и регенерации, изучается функционирование нервной системы, решается ряд других актуальных проблем биологии и современной медицины. Существует генно-инженерный человеческий инсулин, получаемый с помощью ГМ бактерий. В с/х: вопрос 58. В общем про плюсы и минусы: вопрос 57.




Каталог: uploads
uploads -> Представление
uploads -> Городу иркутску 355 лет Иркутский хронограф
uploads -> Лекция «Здравоохранение Амурской области»
uploads -> Закон о промышленной безопасности опасных
uploads -> Литература О. Николенко п. 1 читать, п. 2-4 конспект; читать Педро Кальдерон "Життя-це сон"
uploads -> Дрижд николай александрович
uploads -> Становление советского флота
uploads -> Грузовое судно, которое частично использует солнечную энергию, было построено японскими судостроителями на верфи «Imabari Shipbuilding Industry Ltd»


Поделитесь с Вашими друзьями:
1   2   3   4


База данных защищена авторским правом ©grazit.ru 2019
обратиться к администрации

войти | регистрация
    Главная страница


загрузить материал